Gewinnung autogener Partikel während einer Implantation

Sobald die Menge des gesammelten Knochens analysiert wurde, werden 100 mg Knochen für die übrigen Studienvariablen verwendet.

Die Knochenproben werden 15 Sekunden lang in ein 37 %iges Phosphorsäuregel eingebettet und anschließend mit reichlich Wasser gewaschen, um die restliche Säure zu entfernen. Anschließend werden die Proben nach Erhalt einer Kohlenstoffbeschichtung auf Halterungen montiert und unter dem Rasterelektronenmikroskop untersucht.

Nach der Visualisierung der Proben bei 100-facher Vergrößerung werden digitale Bilder zur Analyse mit der Bildanalysesoftware ImageJ aufgenommen.

Abschließend werden die Kalzium- und Phosphorwerte mit der Software Inca Microanalysis Systems analysiert.

Die Größe wird in nm ausgedrückt.

Die sterilen Eppendorf-Röhrchen mit 100 mg gesammeltem Knochen mit einem der beiden verglichenen Protokolle werden 6 Minuten lang bei 217 g zentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und zur Quantifizierung von BMP-2 und VEGF mithilfe eines ELISA-Kits verwendet. Das Verfahren wird gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll durchgeführt. Die Absorption bei 405 nm wird mit einem ELISA-Lesegerät vom Typ EXL-800 gemessen.

Die Variable wird in % pro 100 mg ausgedrückt

Um die Morphologie und Anzahl der Osteoblasten im während der Mahlsequenz gesammelten Knochen mit den beiden verglichenen Protokollen zu vergleichen, werden die 100 mg Knochen sofort in α-MEM, ergänzt mit fötalem Rinderserum und 1 % Antibiotikum (Penicillin 10.000 U/ml), kultiviert und Streptomycin 10.000 µg/ml) Das Kulturmedium wird alle 3 Tage gewechselt.

Die Morphologie und Anzahl der kultivierten Osteoblasten werden nach 7 und 14 Tagen beobachtet. Nach der Visualisierung unter einem optischen 40-fach-Mikroskop wird die Morphologie als normal oder abnormal beschrieben.

Die Variable wird in % pro 100 mg ausgedrückt

Um das mögliche Vorhandensein präzipitierter Kalziumknötchen in der Zellkultur von Osteoblasten nach der Knochenentnahme während der Mahlsequenz mit den beiden verglichenen Protokollen zu vergleichen, werden wir die vierte Passage kultivierter Osteoblasten (nach 21 Tagen der Kultivierung) verwenden. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, 1 Stunde lang mit 75 % kaltem Ethanol fixiert und 10 Minuten lang mit 1 ml 0,1 % Alizarinrot bei pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) inkubiert. Wenn dann ausgefällte Kalziumknötchen vorhanden sind, werden diese rot gefärbt und unter dem Lichtmikroskop betrachtet. Abschließend verwenden wir 10 Minuten lang eine Lösung aus 20 % Methanol und 10 % Essigsäure, um das Alizarinrot aufzulösen. Die Ergebnisse werden qualitativ ausgedrückt, indem die Absorption bei 550 nm mit einem ELISA-Lesegerät vom Typ EXL-800 gemessen wird.

Die Variable wird in % ausgedrückt

Wir werden auch die vierte Passage kultivierter Osteoblasten verwenden (nach 21 Tagen der Kultivierung). Die Zellen werden in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 1 x 103 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Die Zellproliferation wird nach 2, 6 und 12 Tagen Inkubation mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT)-Assay beurteilt. Zunächst werden 20 µl MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) zum Medium gegeben und 4 Stunden lang inkubiert. Anschließend entfernen wir das Medium und geben 150 µl Dimethylsulfoxid (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) in jede Vertiefung. Die Ergebnisse werden durch Messung der Absorption bei 490 nm analysiert.

Die Variable wird in % ausgedrückt

Für die Untersuchung des Zellzyklus werden wir auch die vierte Passage kultivierter Osteoblasten (nach 21 Tagen der Kultivierung) verwenden. Die Zellen werden mit 0,05 % Trypsin (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) und 0,02 % EDTA aus den Zellkulturflaschen gelöst. Anschließend werden sie gewaschen und zur Zellzyklusanalyse in PBS suspendiert. Die Zellen werden 30 Minuten lang bei 37 °C mit 100 ml RNase (1 mg/ml) und 100 ml Propidiumiodid inkubiert.

Der DNA-Gehalt der gefärbten Zellen wird mit einem FACSCaliburTM-Durchflusszytometer mit einem 488-nm-Argonlaser untersucht, um Daten zur Vorwärtsstreuung (FSC), zur Seitenstreuung (SSC) und zur Propidiumiodid-Fluoreszenzintensität (PLA-2) von 2000 Ereignissen zu sammeln. Die Daten werden mit der CELLQUEST-Software und dem MODFIT-Programm analysiert und der Prozentsatz der Zellen in den Phasen G0/G1, G2/M und S bestimmt.

Die Variable wird in % ausgedrückt

Für die Untersuchung der Zellmigrationsfähigkeit werden wir auch die vierte Passage kultivierter Osteoblasten (nach 21 Tagen der Kultivierung) verwenden. Die Zellen werden in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 5 x 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert, um eine 100-prozentige Konfluenz zu erreichen. Anschließend werden mit einer sterilen 300-µl-Pipettenspitze drei parallele Linien in jede Vertiefung gezogen, um leere Zellräume zu schaffen, und die Zellmigration wird nach 6, 12 und 24 Stunden beobachtet.

Die Zellmigration wird mithilfe des MIP-4.5-Bildanalysesystems bestimmt. Unter Verwendung digitaler Bilder jedes Wells nach 6, 12 und 24 Stunden werden 10 Trennungs-/Annäherungslinien der leeren Zellräume gemessen und die von den Zellen zurückgelegte Distanz anhand der Formel berechnet: Migrationsdistanz = (A0/ 2) – (At/2), wobei A0 die anfängliche Breite des zellfreien Raums und At die Breite des zellfreien Raums nach 6, 12 oder 24 Stunden ist.

Die Variable wird in % ausgedrückt

Die Zelllebensfähigkeitsverhältnisse von Osteoblasten werden am 14. Tag untersucht. Die Zellen werden mit 0,05 % Trypsin (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) aus den Zellkulturflaschen getrennt und mit einer Neubauer-Kammer quantifiziert. Anschließend werden die Zellen mit Trypanblau gefärbt, um die Lebensfähigkeitsverhältnisse der Zellen zu bestimmen.

Die Variable wird in % pro 100 mg ausgedrückt