Høsting av autogene partikler under implantatkirurgi

Når mengden oppsamlet bein er analysert, vil 100 mg bein bli brukt for de resterende studievariablene.

Benprøvene vil bli innebygd i en 37 % fosforsyregel i 15 sekunder og deretter vasket med mye vann for å fjerne den gjenværende syren. Deretter vil prøvene bli montert på holdere for undersøkelse under skanningselektronmikroskopet etter å ha mottatt et karbonbelegg.

Etter å ha visualisert prøvene ved 100X, vil digitale bilder bli tatt for analyse ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren ImageJ.

Til slutt vil kalsium- og fosfornivåer analyseres ved hjelp av Inca Microanalysis Systems-programvaren.

Størrelsen vil bli uttrykt i nm.

De sterile Eppendorf-rørene som inneholder 100 mg oppsamlet bein med en av de to sammenlignede protokollene vil bli sentrifugert ved 217 g i 6 minutter. Supernatanten vil bli samlet og brukt til å kvantifisere BMP-2 og VEGF ved bruk av et ELISA-sett. Prosedyren vil bli utført i henhold til protokollen gitt av produsenten. Absorbans ved 405 nm vil bli målt med en EXL-800 type ELISA-leser.

Variabelen vil bli uttrykt i % per 100 mg

For å sammenligne morfologien og antall osteoblaster i benet samlet under fresesekvensen med de to sammenlignede protokollene, vil de 100 mg beinet umiddelbart dyrkes i α-MEM supplert med føtalt bovint serum og 1 % antibiotika (penicillin 10 000 U/ml og streptomycin 10 000 µg/ml) Dyrkningsmediet vil skiftes hver 3. dag.

Morfologien og antallet dyrkede osteoblaster vil bli observert etter 7 og 14 dager. Etter visualisering under et 40X optisk mikroskop vil morfologien beskrives som normal eller unormal.

Variabelen vil bli uttrykt i % per 100 mg

For å sammenligne mulig tilstedeværelse av utfelte kalsiumknuter i cellekulturen til osteoblaster etter innsamling av bein under fresesekvensen med de to sammenlignede protokollene, vil vi bruke den fjerde passasjen av dyrkede osteoblaster (ved 21 dagers dyrking). Celler vil bli vasket med PBS, fiksert med 75 % kald etanol i 1 time og inkubert med 1 ml 0,1 % alizarinrødt ved pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spania) i 10 minutter. Deretter, hvis det er utfelte kalsiumknuter, vil de farges røde og observeres under det optiske mikroskopet. Til slutt vil vi bruke en løsning av 20 % metanol og 10 % eddiksyre i 10 minutter for å løse opp alizarinrødt. Resultatene vil bli uttrykt kvalitativt ved å måle absorbansen ved 550 nm ved bruk av en EXL-800 type ELISA-leser.

Variabelen vil bli uttrykt i %

Vi vil også bruke den fjerde passasjen av dyrkede osteoblaster (ved 21 dagers dyrking). Cellene vil bli sådd i 96-brønners kulturplater med en tetthet på 1 X 103 celler per brønn. Celleproliferasjon vil bli vurdert etter 2, 6 og 12 dagers inkubasjon ved bruk av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT)-analysen. Først vil 20 µl MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spania) tilsettes til mediet og inkuberes i 4 timer. Deretter vil vi fjerne mediet og tilsette 150 µl dimetylsulfoksid (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spania) til hver brønn. Resultatene vil bli analysert ved å måle absorbans ved 490 nm.

Variabelen vil bli uttrykt i %

For studiet av cellesyklusen vil vi også bruke den fjerde passasjen av dyrkede osteoblaster (ved 21 dagers dyrking). Celler vil bli løsnet fra cellekulturflaskene ved å bruke 0,05 % trypsin (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spania) og 0,02 % EDTA. Etterpå vil de bli vasket og suspendert i PBS for cellesyklusanalyse. Cellene vil bli inkubert ved 37ºC i 30 minutter med 100 ml RNase (1 mg/ml) og 100 ml propidiumjodid.

DNA-innholdet i de fargede cellene vil bli studert ved å bruke et FACSCaliburTM flowcytometer med en 488 nm argonlaser for å samle data fra 2000 hendelser. Dataene vil bli analysert ved å bruke CELLQUEST-programvaren og MODFIT-programmet, og bestemme prosentandelen av celler i G0/G1-, G2/M- og S-faser.

Variabelen vil bli uttrykt i %

For studiet av cellemigrasjonsevne vil vi også bruke den fjerde passasjen av dyrkede osteoblaster (ved 21 dagers dyrking). Celler vil bli sådd i 6-brønners kulturplater med en tetthet på 5 X 104 celler per brønn og inkubert i 24 timer for å nå 100 % konfluens. Deretter vil 3 parallelle linjer bli tegnet i hver brønn ved hjelp av en steril 300 µl pipettespiss for å skape tomme celleplasser, og cellemigrasjon vil bli observert etter 6, 12 og 24 timer.

Cellemigrasjon vil bli bestemt ved å bruke MIP-4.5 bildeanalysesystemet. Ved å bruke digitale bilder av hver brønn etter 6, 12 og 24 timer, vil 10 linjer med separasjon/tilnærming til de tomme celleområdene bli målt, og avstanden som cellene har tilbakelagt, beregnes ved hjelp av formelen: migrasjonsavstand = (A0/ 2) - (At/2), hvor A0 er den opprinnelige bredden på det cellefrie rommet, og At er bredden på det cellefrie rommet ved 6, 12 eller 24 timer.

Variabelen vil bli uttrykt i %

Cellelevedyktighetsforhold for osteoblaster vil bli studert på dag 14. Celler vil bli separert fra cellekulturkolbene ved å bruke 0,05 % trypsin (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spania) og kvantifiseres ved bruk av et Neubauer-kammer. Deretter vil cellene farges med trypanblått for å bestemme cellelevedyktighetsforhold.

Variabelen vil bli uttrykt i % per 100 mg