Pobieranie cząstek autogennych podczas operacji implantacyjnej

Po przeanalizowaniu ilości pobranej kości, 100 mg kości zostanie wykorzystane do pozostałych zmiennych badania.

Próbki kości zostaną zatopione w 37% żelu kwasu fosforowego na 15 sekund, a następnie przemyte dużą ilością wody w celu usunięcia pozostałego kwasu. Następnie próbki zostaną zamontowane na uchwytach w celu zbadania pod skaningowym mikroskopem elektronowym po otrzymaniu powłoki węglowej.

Po wizualizacji próbek w powiększeniu 100X zostaną pobrane obrazy cyfrowe do analizy przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu ImageJ.

Na koniec zbadane zostaną poziomy wapnia i fosforu przy użyciu oprogramowania Inca Microanalytic Systems.

Rozmiar będzie wyrażony w nm.

Sterylne probówki Eppendorfa zawierające 100 mg pobranej kości przy użyciu jednego z dwóch porównywanych protokołów będą wirowane przy 217 g przez 6 minut. Supernatant zostanie zebrany i użyty do ilościowego oznaczenia BMP-2 i VEGF przy użyciu zestawu ELISA. Procedura zostanie przeprowadzona zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Absorbancję przy 405 nm mierzy się stosując czytnik ELISA typu EXL-800.

Zmienna będzie wyrażona w % na 100 mg

Aby porównać morfologię i liczbę osteoblastów w kości pobranych podczas sekwencji mielenia z dwoma porównywanymi protokołami, 100 mg kości będzie natychmiast hodowane w α-MEM uzupełnionym płodową surowicą bydlęcą i 1% antybiotykiem (penicylina 10 000 U/ml i streptomycyna 10 000 µg/ml) Pożywka hodowlana będzie zmieniana co 3 dni.

Morfologię i liczbę hodowanych osteoblastów będzie można obserwować po 7 i 14 dniach. Po wizualizacji pod mikroskopem optycznym 40X morfologia zostanie opisana jako normalna lub nienormalna.

Zmienna będzie wyrażona w % na 100 mg

Aby porównać możliwą obecność wytrąconych guzków wapnia w hodowli komórkowej osteoblastów po pobraniu kości podczas sekwencji mielenia z dwoma porównywanymi protokołami, wykorzystamy czwarty pasaż hodowanych osteoblastów (po 21 dniach hodowli). Komórki zostaną przemyte PBS, utrwalone 75% zimnym etanolem przez 1 godzinę i inkubowane z 1 ml 0,1% czerwieni alizarynowej o pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madryt, Hiszpania) przez 10 minut. Następnie, jeśli wytrącą się grudki wapnia, zostaną one zabarwione na czerwono i obserwowane pod mikroskopem optycznym. Na koniec użyjemy roztworu 20% metanolu i 10% kwasu octowego przez 10 minut, aby rozpuścić czerwień alizarynową. Wyniki zostaną wyrażone jakościowo poprzez pomiar absorbancji przy 550 nm przy użyciu czytnika ELISA typu EXL-800.

Zmienna będzie wyrażona w %

Wykorzystamy także czwarty pasaż hodowanych osteoblastów (w 21 dniu hodowli). Komórki zostaną wysiane w 96-dołkowych płytkach hodowlanych przy gęstości 1 x 103 komórek na dołek. Proliferację komórek ocenia się po 2, 6 i 12 dniach inkubacji, stosując test z bromkiem 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazolium (MTT). Najpierw do pożywki zostanie dodane 20 µl MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madryt, Hiszpania) i inkubacja przez 4 godziny. Następnie usuniemy podłoże i do każdego dołka dodamy 150 µl sulfotlenku dimetylu (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madryt, Hiszpania). Wyniki będą analizowane poprzez pomiar absorbancji przy 490 nm.

Zmienna będzie wyrażona w %

Do badania cyklu komórkowego wykorzystamy także czwarty pasaż hodowanych osteoblastów (w 21 dniu hodowli). Komórki zostaną odłączone od kolb do hodowli komórkowych przy użyciu 0,05% trypsyny (Sigma-Aldrich Quimica SA, Madryt, Hiszpania) i 0,02% EDTA. Następnie zostaną one przemyte i zawieszone w PBS do analizy cyklu komórkowego. Komórki będą inkubowane w temperaturze 37°C przez 30 minut ze 100 ml RNazy (1 mg/ml) i 100 ml jodku propidyny.

Zawartość DNA w wybarwionych komórkach będzie badana przy użyciu cytometru przepływowego FACSCaliburTM z laserem argonowym o długości fali 488 nm w celu zebrania danych dotyczących rozproszenia przedniego (FSC), rozproszenia bocznego (SSC) i intensywności fluorescencji jodku propidyny (PLA-2) z 2000 zdarzeń. Dane będą analizowane przy użyciu programów CELLQUEST i MODFIT, określając procent komórek w fazach G0/G1, G2/M i S.

Zmienna będzie wyrażona w %

Do badania zdolności migracji komórek wykorzystamy również czwarty pasaż hodowanych osteoblastów (w 21 dniu hodowli). Komórki zostaną wysiane na 6-dołkowe płytki hodowlane przy gęstości 5 x 104 komórek na dołek i inkubowane przez 24 godziny do osiągnięcia 100% konfluencji. Następnie w każdym dołku zostaną narysowane 3 równoległe linie przy użyciu sterylnej końcówki pipety o pojemności 300 µl w celu utworzenia pustych przestrzeni na komórki i będzie obserwowana migracja komórek po 6, 12 i 24 godzinach.

Migracja komórek zostanie określona przy użyciu systemu analizy obrazu MIP-4.5. Korzystając z cyfrowych obrazów każdego dołka po 6, 12 i 24 godzinach, zmierzonych zostanie 10 linii separacji/zbliżenia pustych przestrzeni komórek, a odległość przebyta przez komórki zostanie obliczona przy użyciu wzoru: odległość migracji = (A0/ 2) - (At/2), gdzie A0 jest początkową szerokością przestrzeni wolnej od komórek, a At jest szerokością przestrzeni wolnej od komórek po 6, 12 lub 24 godzinach.

Zmienna będzie wyrażona w %

Współczynniki żywotności komórek osteoblastów będą badane w dniu 14. Komórki zostaną oddzielone od kolb do hodowli komórkowych przy użyciu 0,05% trypsyny (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madryt, Hiszpania) i określone ilościowo przy użyciu komory Neubauera. Następnie komórki zostaną wybarwione błękitem trypanowym w celu określenia współczynników żywotności komórek.

Zmienna będzie wyrażona w % na 100 mg