Høst af autogene partikler under implantatkirurgi

Når mængden af ​​opsamlet knogle er blevet analyseret, vil 100 mg knogle blive brugt til de resterende undersøgelsesvariable.

Knogleprøverne vil blive indlejret i en 37 % fosforsyregel i 15 sekunder og derefter vasket med rigeligt vand for at fjerne den resterende syre. Efterfølgende vil prøverne blive monteret på holdere til undersøgelse under scanningselektronmikroskopet efter at have modtaget en kulstofbelægning.

Efter visualisering af prøverne ved 100X, vil digitale billeder blive taget til analyse ved hjælp af billedanalysesoftwaren ImageJ.

Til sidst vil calcium- og fosforniveauer blive analyseret ved hjælp af Inca Microanalysis Systems software.

Størrelsen vil blive udtrykt i nm.

De sterile Eppendorf-rør indeholdende 100 mg opsamlet knogle med en af ​​de to sammenlignede protokoller vil blive centrifugeret ved 217 g i 6 minutter. Supernatanten vil blive opsamlet og brugt til at kvantificere BMP-2 og VEGF ved hjælp af et ELISA-kit. Proceduren vil blive udført i overensstemmelse med producentens protokol. Absorbans ved 405 nm vil blive målt ved hjælp af en EXL-800 type ELISA-læser.

Variablen vil blive udtrykt i % pr. 100 mg

For at sammenligne morfologien og antallet af osteoblaster i knoglen opsamlet under formalingssekvensen med de to sammenlignede protokoller, vil de 100 mg knogle omgående blive dyrket i α-MEM suppleret med føtalt bovint serum og 1 % antibiotikum (penicillin 10.000 U/ml og streptomycin 10.000 µg/ml) Dyrkningsmediet vil blive skiftet hver 3. dag.

Morfologien og antallet af dyrkede osteoblaster vil blive observeret efter 7 og 14 dage. Efter visualisering under et 40X optisk mikroskop vil morfologien blive beskrevet som normal eller unormal.

Variablen vil blive udtrykt i % pr. 100 mg

For at sammenligne den mulige tilstedeværelse af udfældede calciumknuder i cellekulturen af ​​osteoblaster efter opsamling af knogle under formalingssekvensen med de to sammenlignede protokoller, vil vi bruge den fjerde passage af dyrkede osteoblaster (ved 21 dages dyrkning). Celler vil blive vasket med PBS, fikseret med 75 % kold ethanol i 1 time og inkuberet med 1 ml 0,1 % alizarinrød ved pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) i 10 minutter. Så, hvis der er udfældede calciumknuder, vil de farves røde og observeres under det optiske mikroskop. Til sidst vil vi bruge en opløsning af 20% methanol og 10% eddikesyre i 10 minutter til at opløse alizarin rødt. Resultater vil blive udtrykt kvalitativt ved at måle absorbans ved 550 nm ved hjælp af en EXL-800 type ELISA-læser.

Variablen vil blive udtrykt i %

Vi vil også bruge den fjerde passage af dyrkede osteoblaster (ved 21 dages dyrkning). Cellerne vil blive podet i 96-brønds kulturplader ved en tæthed på 1 X 103 celler pr. brønd. Celleproliferation vil blive vurderet efter 2, 6 og 12 dages inkubation under anvendelse af 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) assayet. Først tilsættes 20 µl MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) til mediet og inkuberes i 4 timer. Efterfølgende vil vi fjerne mediet og tilsætte 150 µl dimethylsulfoxid (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) til hver brønd. Resultaterne vil blive analyseret ved at måle absorbans ved 490 nm.

Variablen vil blive udtrykt i %

Til studiet af cellecyklussen vil vi også bruge den fjerde passage af dyrkede osteoblaster (ved 21 dages dyrkning). Celler vil blive løsrevet fra cellekulturkolberne under anvendelse af 0,05 % trypsin (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) og 0,02 % EDTA. Bagefter vil de blive vasket og suspenderet i PBS til cellecyklusanalyse. Cellerne inkuberes ved 37ºC i 30 minutter med 100 ml RNase (1 mg/ml) og 100 ml propidiumiodid.

DNA-indholdet i de farvede celler vil blive undersøgt ved hjælp af et FACSCaliburTM flowcytometer med en 488 nm argonlaser til at indsamle data fra 2000 hændelser. Dataene vil blive analyseret ved hjælp af CELLQUEST-softwaren og MODFIT-programmet, der bestemmer procentdelen af ​​celler i G0/G1-, G2/M- og S-faser.

Variablen vil blive udtrykt i %

Til undersøgelse af cellemigrationsevne vil vi også bruge den fjerde passage af dyrkede osteoblaster (ved 21 dages dyrkning). Celler vil blive podet i 6-brønds kulturplader ved en tæthed på 5 X 104 celler pr. brønd og inkuberet i 24 timer for at nå 100% sammenløb. Efterfølgende vil 3 parallelle linjer blive tegnet i hver brønd ved hjælp af en steril 300 µl pipettespids for at skabe tomme cellerum, og cellemigration vil blive observeret efter 6, 12 og 24 timer.

Cellemigration vil blive bestemt ved hjælp af MIP-4.5 billedanalysesystemet. Ved hjælp af digitale billeder af hver brønd efter 6, 12 og 24 timer vil 10 linjers adskillelse/tilnærmelse af de tomme cellerum blive målt, og afstanden tilbagelagt af cellerne vil blive beregnet ved hjælp af formlen: migrationsafstand = (A0/ 2) - (At/2), hvor A0 er den indledende bredde af det cellefrie rum, og At er bredden af ​​det cellefrie rum ved 6, 12 eller 24 timer.

Variablen vil blive udtrykt i %

Cellelevedygtighedsforhold for osteoblaster vil blive undersøgt på dag 14. Celler vil blive adskilt fra cellekulturkolberne under anvendelse af 0,05% trypsin (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) og kvantificeret ved anvendelse af et Neubauer-kammer. Derefter vil celler blive farvet med trypanblåt for at bestemme cellelevedygtighedsforhold.

Variablen vil blive udtrykt i % pr. 100 mg