Coleta de partículas autógenas durante cirurgia de implante

Uma vez analisada a quantidade de osso coletado, 100 mg de osso serão utilizados para as demais variáveis ​​do estudo.

As amostras ósseas serão embebidas em gel de ácido fosfórico a 37% por 15 segundos e depois lavadas com água em abundância para remoção do ácido remanescente. Posteriormente, as amostras serão montadas em suportes para exame ao microscópio eletrônico de varredura após receberem revestimento de carbono.

Após a visualização das amostras em 100X, imagens digitais serão obtidas para análise utilizando o software de análise de imagens ImageJ.

Por fim, os níveis de cálcio e fósforo serão analisados ​​utilizando o software Inca Microlysis Systems.

O tamanho será expresso em nm.

Os tubos Eppendorf estéreis contendo 100 mg de osso coletado com um dos dois protocolos comparados serão centrifugados a 217 g por 6 minutos. O sobrenadante será coletado e utilizado para quantificar BMP-2 e VEGF utilizando kit ELISA. O procedimento será realizado seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. A absorvância a 405 nm será medida utilizando um leitor ELISA tipo EXL-800.

A variável será expressa em % por 100mg

Para comparar a morfologia e o número de osteoblastos no osso coletado durante a sequência de fresagem com os dois protocolos comparados, os 100 mg de osso serão imediatamente cultivados em α-MEM suplementado com soro fetal bovino e antibiótico a 1% (penicilina 10.000 U/ml e estreptomicina 10.000 µg/ml) O meio de cultura será trocado a cada 3 dias.

A morfologia e o número de osteoblastos cultivados serão observados aos 7 e 14 dias. Após visualização em microscópio óptico de 40X, a morfologia será descrita como normal ou anormal.

A variável será expressa em % por 100mg

Para comparar a possível presença de nódulos de cálcio precipitados na cultura celular de osteoblastos após coleta óssea durante a sequência de moagem com os dois protocolos comparados, utilizaremos a quarta passagem de osteoblastos cultivados (aos 21 dias de cultivo). As células serão lavadas com PBS, fixadas com etanol 75% frio por 1 hora e incubadas com 1 ml de vermelho de alizarina 0,1% em pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Espanha) por 10 minutos. Então, se houver nódulos de cálcio precipitados, eles serão corados de vermelho e observados ao microscópio óptico. Por fim, utilizaremos uma solução de metanol 20% e ácido acético 10% por 10 minutos para dissolver o vermelho de alizarina. Os resultados serão expressos qualitativamente medindo a absorbância a 550 nm usando um leitor ELISA tipo EXL-800.

A variável será expressa em %

Também utilizaremos a quarta passagem de osteoblastos cultivados (aos 21 dias de cultivo). As células serão semeadas em placas de cultura de 96 poços a uma densidade de 1 x 103 células por poço. A proliferação celular será avaliada aos 2, 6 e 12 dias de incubação usando o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). Primeiramente, 20 µl de MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Espanha) serão adicionados ao meio e incubados por 4 horas. Posteriormente, retiraremos o meio e adicionaremos 150 µl de dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Espanha) em cada poço. Os resultados serão analisados ​​medindo a absorbância a 490 nm.

A variável será expressa em %

Para o estudo do ciclo celular, utilizaremos também a quarta passagem de osteoblastos cultivados (aos 21 dias de cultivo). As células serão destacadas dos frascos de cultura celular utilizando tripsina 0,05% (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Espanha) e EDTA 0,02%. Posteriormente, serão lavados e suspensos em PBS para análise do ciclo celular. As células serão incubadas a 37º C por 30 minutos com 100 ml de RNase (1 mg/ml) e 100 ml de iodeto de propídio.

O conteúdo de DNA das células coradas será estudado usando um citômetro de fluxo FACSCaliburTM com um laser de argônio de 488 nm para coletar dados de dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) e intensidade de fluorescência de iodeto de propídio (PLA-2) de eventos de 2000. Os dados serão analisados ​​utilizando o software CELLQUEST e o programa MODFIT, determinando-se a porcentagem de células nas fases G0/G1, G2/M e S.

A variável será expressa em %

Para o estudo da capacidade de migração celular, utilizaremos também a quarta passagem de osteoblastos cultivados (aos 21 dias de cultivo). As células serão semeadas em placas de cultura de 6 poços a uma densidade de 5 x 104 células por poço e incubadas durante 24 horas para atingir 100% de confluência. Posteriormente, 3 linhas paralelas serão desenhadas em cada poço usando uma ponta de pipeta estéril de 300 µl para criar espaços celulares vazios, e a migração celular será observada às 6, 12 e 24 horas.

A migração celular será determinada utilizando o sistema de análise de imagem MIP-4.5. Utilizando imagens digitais de cada poço às 6, 12 e 24 horas, serão medidas 10 linhas de separação/aproximação dos espaços celulares vazios, e a distância percorrida pelas células será calculada através da fórmula: distância de migração = (A0/ 2) - (At/2), onde A0 é a largura inicial do espaço livre de células e At é a largura do espaço livre de células às 6, 12 ou 24 horas.

A variável será expressa em %

As taxas de viabilidade celular dos osteoblastos serão estudadas no dia 14. As células serão separadas dos frascos de cultura celular utilizando tripsina 0,05% (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Espanha) e quantificadas em câmara de Neubauer. Em seguida, as células serão coradas com azul de tripano para determinar as taxas de viabilidade celular.

A variável será expressa em % por 100mg