Autogena partiklar skörd under implantatkirurgi

När mängden uppsamlat ben har analyserats kommer 100 mg ben att användas för de återstående studievariablerna.

Benproverna kommer att bäddas in i en 37 % fosforsyragel i 15 sekunder och tvättas sedan med mycket vatten för att avlägsna den återstående syran. Därefter kommer proverna att monteras på hållare för undersökning under svepelektronmikroskopet efter att ha fått en kolbeläggning.

Efter att ha visualiserat proverna vid 100X kommer digitala bilder att tas för analys med hjälp av bildanalysmjukvaran ImageJ.

Slutligen kommer kalcium- och fosfornivåerna att analyseras med hjälp av programvaran Inca Microanalysis Systems.

Storleken kommer att uttryckas i nm.

De sterila Eppendorf-rören som innehåller 100 mg uppsamlat ben med ett av de två jämförda protokollen kommer att centrifugeras vid 217 g under 6 minuter. Supernatanten kommer att samlas upp och användas för att kvantifiera BMP-2 och VEGF med användning av ett ELISA-kit. Proceduren kommer att utföras enligt det protokoll som tillhandahålls av tillverkaren. Absorbans vid 405 nm kommer att mätas med en EXL-800 typ ELISA-läsare.

Variabeln kommer att uttryckas i % per 100 mg

För att jämföra morfologin och antalet osteoblaster i benet som samlats in under malningssekvensen med de två jämförda protokollen kommer de 100 mg ben omedelbart att odlas i α-MEM kompletterat med fetalt bovint serum och 1 % antibiotika (penicillin 10 000 U/ml och streptomycin 10 000 µg/ml) Odlingsmediet kommer att bytas var tredje dag.

Morfologin och antalet odlade osteoblaster kommer att observeras efter 7 och 14 dagar. Efter visualisering under ett 40X optiskt mikroskop kommer morfologin att beskrivas som normal eller onormal.

Variabeln kommer att uttryckas i % per 100 mg

För att jämföra den möjliga närvaron av utfällda kalciumknölar i cellkulturen av osteoblaster efter att ha samlat ben under malningssekvensen med de två jämförda protokollen, kommer vi att använda den fjärde passagen av odlade osteoblaster (vid 21 dagars odling). Celler kommer att tvättas med PBS, fixeras med 75 % kall etanol under 1 timme och inkuberas med 1 ml 0,1 % alizarinrött vid pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) under 10 minuter. Sedan, om det finns utfällda kalciumknölar, kommer de att färgas röda och observeras under det optiska mikroskopet. Slutligen kommer vi att använda en lösning av 20% metanol och 10% ättiksyra i 10 minuter för att lösa upp alizarinröd. Resultaten kommer att uttryckas kvalitativt genom att mäta absorbansen vid 550 nm med en ELISA-läsare av EXL-800-typ.

Variabeln kommer att uttryckas i %

Vi kommer också att använda den fjärde passagen av odlade osteoblaster (vid 21 dagars odling). Cellerna sås i odlingsplattor med 96 brunnar med en densitet av 1 X 103 celler per brunn. Cellproliferation kommer att bedömas vid 2, 6 och 12 dagars inkubation med användning av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT)-analysen. Först tillsätts 20 µl MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) till mediet och inkuberas i 4 timmar. Därefter tar vi bort mediet och tillsätter 150 µl dimetylsulfoxid (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) till varje brunn. Resultaten kommer att analyseras genom att mäta absorbansen vid 490 nm.

Variabeln kommer att uttryckas i %

För studien av cellcykeln kommer vi också att använda den fjärde passagen av odlade osteoblaster (vid 21 dagars odling). Celler kommer att lossas från cellodlingsflaskorna med användning av 0,05 % trypsin (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) och 0,02 % EDTA. Efteråt kommer de att tvättas och suspenderas i PBS för cellcykelanalys. Cellerna kommer att inkuberas vid 37°C i 30 minuter med 100 ml RNas (1 mg/ml) och 100 ml propidiumjodid.

DNA-innehållet i de färgade cellerna kommer att studeras med hjälp av en FACSCaliburTM flödescytometer med en 488 nm argonlaser för att samla in data från 2000 händelser. Data kommer att analyseras med CELLQUEST-programvaran och MODFIT-programmet, vilket bestämmer procentandelen celler i G0/G1-, G2/M- och S-faserna.

Variabeln kommer att uttryckas i %

För studien av cellmigrationsförmåga kommer vi också att använda den fjärde passagen av odlade osteoblaster (vid 21 dagars odling). Celler sås i odlingsplattor med 6 brunnar med en densitet av 5 X 104 celler per brunn och inkuberas i 24 timmar för att nå 100 % sammanflöde. Därefter kommer 3 parallella linjer att dras i varje brunn med hjälp av en steril 300 µl pipettspets för att skapa tomma cellutrymmen, och cellmigrering kommer att observeras efter 6, 12 och 24 timmar.

Cellmigrering kommer att bestämmas med hjälp av MIP-4.5-bildanalyssystemet. Med hjälp av digitala bilder av varje brunn vid 6, 12 och 24 timmar, kommer 10 rader av separation/tillvägagångssätt för de tomma cellutrymmena att mätas, och avståndet som cellerna tillryggalagt kommer att beräknas med formeln: migrationsavstånd = (A0/ 2) - (At/2), där A0 är den initiala bredden på det cellfria utrymmet och At är bredden på det cellfria utrymmet vid 6, 12 eller 24 timmar.

Variabeln kommer att uttryckas i %

Cellviabilitetsförhållanden för osteoblaster kommer att studeras på dag 14. Celler kommer att separeras från cellodlingsflaskorna med användning av 0,05 % trypsin (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanien) och kvantifieras med användning av en Neubauer-kammare. Sedan kommer celler att färgas med trypanblått för att bestämma cellviabilitetsförhållanden.

Variabeln kommer att uttryckas i % per 100 mg