Autogene deeltjes verzamelen tijdens implantaatchirurgie

Zodra de hoeveelheid verzameld bot is geanalyseerd, wordt 100 mg bot gebruikt voor de overige onderzoeksvariabelen.

De botmonsters worden gedurende 15 seconden ingebed in een 37% fosforzuurgel en vervolgens gewassen met veel water om het resterende zuur te verwijderen. Vervolgens worden de monsters, nadat ze zijn voorzien van een koolstofcoating, op houders gemonteerd voor onderzoek onder de scanning-elektronenmicroscoop.

Nadat de monsters op 100X zijn gevisualiseerd, worden digitale beelden gemaakt voor analyse met behulp van de beeldanalysesoftware ImageJ.

Ten slotte zullen de calcium- en fosforniveaus worden geanalyseerd met behulp van de Inca Microanalysis Systems-software.

De grootte wordt uitgedrukt in nm.

De steriele Eppendorf-buisjes met 100 mg verzameld bot met een van de twee vergeleken protocollen zullen gedurende 6 minuten bij 217 g worden gecentrifugeerd. Het supernatant zal worden verzameld en gebruikt om BMP-2 en VEGF te kwantificeren met behulp van een ELISA-kit. De procedure wordt uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. De absorptie bij 405 nm zal worden gemeten met behulp van een ELISA-lezer van het type EXL-800.

De variabele wordt uitgedrukt in % per 100 mg

Om de morfologie en het aantal osteoblasten in het bot dat tijdens het maalproces is verzameld met de twee vergeleken protocollen te vergelijken, zal de 100 mg bot onmiddellijk worden gekweekt in α-MEM aangevuld met foetaal runderserum en 1% antibioticum (penicilline 10.000 U/ml en streptomycine 10.000 µg/ml) Het kweekmedium wordt elke 3 dagen vervangen.

De morfologie en het aantal gekweekte osteoblasten zullen na 7 en 14 dagen worden waargenomen. Na visualisatie onder een 40X optische microscoop zal de morfologie worden beschreven als normaal of abnormaal.

De variabele wordt uitgedrukt in % per 100 mg

Om de mogelijke aanwezigheid van neergeslagen calciumknobbeltjes in de celkweek van osteoblasten na het verzamelen van bot tijdens de maalsequentie met de twee vergeleken protocollen te vergelijken, zullen we de vierde passage van gekweekte osteoblasten gebruiken (na 21 dagen kweken). De cellen worden gewassen met PBS, gedurende 1 uur gefixeerd met 75% koude ethanol en gedurende 10 minuten geïncubeerd met 1 ml 0,1% alizarinerood bij pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanje). Als er vervolgens calciumknobbels zijn neergeslagen, worden deze rood gekleurd en onder de optische microscoop bekeken. Ten slotte zullen we gedurende 10 minuten een oplossing van 20% methanol en 10% azijnzuur gebruiken om het alizarinerood op te lossen. De resultaten zullen kwalitatief worden uitgedrukt door de absorptie bij 550 nm te meten met behulp van een ELISA-lezer van het type EXL-800.

De variabele wordt uitgedrukt in%

We zullen ook de vierde passage van gekweekte osteoblasten gebruiken (na 21 dagen kweken). De cellen zullen worden uitgezaaid in kweekplaten met 96 putjes met een dichtheid van 1 x 103 cellen per putje. Celproliferatie zal worden beoordeeld na 2, 6 en 12 dagen incubatie met behulp van de 3-(4,5-dimethylthiazool-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromide (MTT)-test. Eerst wordt 20 µl MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanje) aan het medium toegevoegd en gedurende 4 uur geïncubeerd. Vervolgens verwijderen we het medium en voegen we 150 µl dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanje) aan elk putje toe. De resultaten zullen worden geanalyseerd door de absorptie bij 490 nm te meten.

De variabele wordt uitgedrukt in%

Voor de studie van de celcyclus zullen we ook de vierde passage van gekweekte osteoblasten gebruiken (na 21 dagen kweken). Cellen zullen worden losgemaakt van de celkweekflessen met behulp van 0,05% trypsine (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanje) en 0,02% EDTA. Daarna worden ze gewassen en gesuspendeerd in PBS voor celcyclusanalyse. De cellen worden gedurende 30 minuten bij 37ºC geïncubeerd met 100 ml RNase (1 mg/ml) en 100 ml propidiumjodide.

De DNA-inhoud van de gekleurde cellen zal worden bestudeerd met behulp van een FACSCaliburTM flowcytometer met een 488 nm argonlaser om gegevens over voorwaartse verstrooiing (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC) en propidiumjodide fluorescentie-intensiteit (PLA-2) van 2000 gebeurtenissen te verzamelen. De gegevens zullen worden geanalyseerd met behulp van de CELLQUEST-software en het MODFIT-programma, waarbij het percentage cellen in de G0/G1-, G2/M- en S-fasen wordt bepaald.

De variabele wordt uitgedrukt in%

Voor de studie van het celmigratievermogen zullen we ook de vierde passage van gekweekte osteoblasten gebruiken (na 21 dagen kweken). De cellen zullen worden gezaaid in kweekplaten met 6 putjes met een dichtheid van 5 x 104 cellen per putje en gedurende 24 uur worden geïncubeerd om een ​​confluentie van 100% te bereiken. Vervolgens worden in elk putje 3 parallelle lijnen getrokken met behulp van een steriele pipettip van 300 µl om lege celruimten te creëren, en wordt de celmigratie na 6, 12 en 24 uur waargenomen.

Celmigratie zal worden bepaald met behulp van het MIP-4.5 beeldanalysesysteem. Met behulp van digitale beelden van elk putje na 6, 12 en 24 uur zullen 10 scheidings-/benaderingslijnen van de lege celruimten worden gemeten, en de door de cellen afgelegde afstand zal worden berekend met behulp van de formule: migratieafstand = (A0/ 2) - (At/2), waarbij A0 de initiële breedte van de celvrije ruimte is, en At de breedte van de celvrije ruimte is na 6, 12 of 24 uur.

De variabele wordt uitgedrukt in%

De cellevensvatbaarheidsverhoudingen van osteoblasten zullen op dag 14 worden bestudeerd. Cellen zullen worden gescheiden van de celkweekflessen met behulp van 0,05% trypsine (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spanje) en gekwantificeerd met behulp van een Neubauer-kamer. Vervolgens worden de cellen gekleurd met trypaanblauw om de levensvatbaarheidsverhoudingen van de cellen te bepalen.

De variabele wordt uitgedrukt in % per 100 mg