임플란트 수술 중 자가 입자 수확

수집된 뼈의 양이 분석되면 나머지 연구 변수에는 100mg의 뼈가 사용됩니다.

뼈 샘플을 37% 인산 젤에 15초 동안 담근 후 다량의 물로 세척하여 남은 산을 제거합니다. 그 후, 샘플은 탄소 코팅을 받은 후 주사 전자 현미경으로 검사하기 위해 홀더에 장착됩니다.

100X에서 샘플을 시각화한 후 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 분석을 위해 디지털 이미지를 촬영합니다.

마지막으로, 칼슘과 인 수준은 Inca Microanalytic Systems 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다.

크기는 nm 단위로 표시됩니다.

비교된 두 프로토콜 중 하나를 사용하여 수집된 뼈 100mg을 포함하는 멸균 Eppendorf 튜브를 6분 동안 217g에서 원심분리합니다. 상층액을 수집하여 ELISA 키트를 사용하여 BMP-2 및 VEGF를 정량화하는 데 사용합니다. 절차는 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 수행됩니다. 405 nm에서의 흡광도는 EXL-800 유형 ELISA 판독기를 사용하여 측정됩니다.

변수는 100mg당 %로 표시됩니다.

두 가지 비교 프로토콜을 사용하여 밀링 시퀀스 동안 수집된 뼈의 조골세포의 형태와 수를 비교하기 위해 100mg의 뼈를 소 태아 혈청과 1% 항생제(페니실린 10,000U/ml)가 보충된 α-MEM에서 즉시 배양합니다. 및 스트렙토마이신 10,000μg/ml) 배양 배지는 3일마다 교체됩니다.

배양된 조골세포의 형태와 수는 7일과 14일에 관찰됩니다. 40X 광학 현미경으로 시각화한 후 형태는 정상 또는 비정상으로 설명됩니다.

변수는 100mg당 %로 표시됩니다.

두 가지 비교 프로토콜을 사용하여 밀링 시퀀스 동안 뼈를 수집한 후 조골세포의 세포 배양에서 침전된 칼슘 결절의 존재 가능성을 비교하기 위해 배양된 조골세포의 네 번째 통과(배양 21일)를 사용합니다. 세포를 PBS로 세척하고, 75% 차가운 에탄올로 1시간 동안 고정하고, pH 8.3의 0.1% 알리자린 레드(Sigma-Aldrich Quimica S.A., 마드리드, 스페인) 1ml와 10분 동안 배양합니다. 그 후 침전된 칼슘 결절이 있으면 붉은색으로 염색되어 광학현미경으로 관찰됩니다. 마지막으로 20% 메탄올과 10% 아세트산 용액을 10분간 사용하여 알리자린 레드를 용해시킵니다. 결과는 EXL-800형 ELISA 리더를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 정성적으로 표현합니다.

변수는 %로 표시됩니다.

또한 배양된 조골세포의 4차 계대(배양 21일)를 사용합니다. 세포는 웰당 1 X 103 세포의 밀도로 96웰 배양 플레이트에 접종됩니다. 세포 증식은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 사용하여 배양 2, 6, 12일에 평가됩니다. 먼저, MTT(Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Spain) 20μl를 배지에 첨가하고 4시간 동안 배양한다. 이어서, 배지를 제거하고 각 웰에 디메틸 설폭사이드(Sigma-Aldrich Quimica S.A., 마드리드, 스페인) 150μl를 추가합니다. 결과는 490 nm에서 흡광도를 측정하여 분석됩니다.

변수는 %로 표시됩니다.

세포주기 연구를 위해 배양된 조골세포의 4차 계대(배양 21일)도 사용합니다. 0.05% 트립신(Sigma-Aldrich Quimica S.A., 마드리드, 스페인) 및 0.02% EDTA를 사용하여 세포를 세포 배양 플라스크에서 분리합니다. 그 후, 세포 주기 분석을 위해 세척하고 PBS에 현탁합니다. 세포를 100ml의 RNase(1mg/ml) 및 100ml의 요오드화 프로피듐과 함께 37°C에서 30분 동안 배양합니다.

염색된 세포의 DNA 함량은 488 nm 아르곤 레이저가 장착된 FACSCalibur™ 유세포 분석기를 사용하여 연구하여 2000년 이벤트에서 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 및 요오드화 프로피듐 형광 강도(PLA-2) 데이터를 수집합니다. 데이터는 CELLQUEST 소프트웨어와 MODFIT 프로그램을 사용하여 분석되어 G0/G1, G2/M 및 S 단계의 세포 비율을 결정합니다.

변수는 %로 표시됩니다.

세포 이동 능력 연구를 위해 배양된 조골세포의 4차 계대(배양 21일)도 사용할 것입니다. 세포는 웰당 5 X 104 세포의 밀도로 6웰 배양 플레이트에 시딩되고 100% 합류에 도달할 때까지 24시간 동안 배양됩니다. 이어서, 멸균된 300μl 피펫 팁을 사용하여 각 웰에 3개의 평행선을 그려 빈 셀 공간을 만들고, 6시간, 12시간, 24시간에 세포 이동을 관찰합니다.

세포 이동은 MIP-4.5 이미지 분석 시스템을 사용하여 결정됩니다. 6시간, 12시간, 24시간에 각 웰의 디지털 이미지를 사용하여 빈 셀 공간의 10개 라인 분리/접근을 측정하고 다음 공식을 사용하여 셀이 이동한 거리를 계산합니다. 이동 거리 = (A0/ 2) - (At/2), 여기서 A0는 초기 무세포 공간의 폭이고, At는 6, 12, 24시간에서의 무세포 공간의 폭이다.

변수는 %로 표시됩니다.

조골세포의 세포 생존율은 14일차에 연구됩니다. 세포는 0.05% 트립신(Sigma-Aldrich Quimica S.A., 마드리드, 스페인)을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 분리되고 Neubauer 챔버를 사용하여 정량화됩니다. 그런 다음 세포 생존율을 결정하기 위해 세포를 트리판 블루로 염색합니다.

변수는 100mg당 %로 표시됩니다.