Сбор аутогенных частиц во время имплантации

После анализа количества собранной кости для остальных переменных исследования будет использовано 100 мг кости.

Образцы костей помещают в гель с 37% фосфорной кислотой на 15 секунд, а затем промывают большим количеством воды для удаления остатков кислоты. В дальнейшем образцы будут закреплены на держателях для исследования под сканирующим электронным микроскопом после получения углеродного покрытия.

После визуализации образцов в 100-кратном увеличении цифровые изображения будут взяты для анализа с использованием программного обеспечения для анализа изображений ImageJ.

Наконец, уровни кальция и фосфора будут проанализированы с использованием программного обеспечения Inca Microanalogue Systems.

Размер будет выражаться в нм.

Стерильные пробирки Эппендорфа, содержащие 100 мг собранной кости по одному из двух сравниваемых протоколов, центрифугируют при 217 g в течение 6 минут. Супернатант будет собран и использован для количественного определения BMP-2 и VEGF с использованием набора ELISA. Процедура будет проводиться по протоколу, предоставленному производителем. Поглощение при 405 нм измеряют с использованием ELISA-ридера типа EXL-800.

Переменная будет выражаться в % на 100 мг.

Чтобы сравнить морфологию и количество остеобластов в кости, собранной во время измельчения, с двумя сравниваемыми протоколами, 100 мг кости будут немедленно культивированы в среде α-MEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика (пенициллин 10 000 ЕД/мл). и стрептомицин 10 000 мкг/мл). Культуральную среду следует менять каждые 3 дня.

Морфологию и количество культивируемых остеобластов будут наблюдать через 7 и 14 дней. После визуализации под 40-кратным оптическим микроскопом морфология будет описываться как нормальная или аномальная.

Переменная будет выражаться в % на 100 мг.

Чтобы сравнить возможное присутствие осажденных кальциевых узелков в культуре клеток остеобластов после сбора кости во время последовательности измельчения с двумя сравниваемыми протоколами, мы будем использовать четвертый пассаж культивируемых остеобластов (на 21 день культивирования). Клетки промывают PBS, фиксируют 75% холодным этанолом в течение 1 часа и инкубируют с 1 мл 0,1% ализаринового красного при pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica SA, Мадрид, Испания) в течение 10 минут. Затем, если есть осажденные кальциевые узелки, их окрашивают в красный цвет и рассматривают под оптическим микроскопом. Наконец, мы будем использовать раствор 20% метанола и 10% уксусной кислоты в течение 10 минут, чтобы растворить ализариновый красный. Результаты будут качественно выражены путем измерения оптической плотности при 550 нм с использованием ELISA-ридера типа EXL-800.

Переменная будет выражена в %

Мы также будем использовать четвертый пассаж культивируемых остеобластов (на 21 день культивирования). Клетки будут высеяны в 96-луночные культуральные планшеты с плотностью 1×103 клеток на лунку. Пролиферацию клеток будут оценивать через 2, 6 и 12 дней инкубации с использованием анализа 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромида (МТТ). Сначала в среду добавляют 20 мкл МТТ (Sigma-Aldrich Quimica SA, Мадрид, Испания) и инкубируют в течение 4 часов. Впоследствии мы удалим среду и добавим в каждую лунку по 150 мкл диметилсульфоксида (Sigma-Aldrich Quimica SA, Мадрид, Испания). Результаты будут проанализированы путем измерения оптической плотности при 490 нм.

Переменная будет выражена в %

Для изучения клеточного цикла мы также будем использовать четвертый пассаж культивируемых остеобластов (на 21 день культивирования). Клетки будут отделены от флаконов с клеточными культурами с использованием 0,05% трипсина (Sigma-Aldrich Quimica SA, Мадрид, Испания) и 0,02% ЭДТА. После этого их промывают и суспендируют в PBS для анализа клеточного цикла. Клетки инкубируют при 37°C в течение 30 минут со 100 мл РНКазы (1 мг/мл) и 100 мл йодида пропидия.

Содержание ДНК в окрашенных клетках будет изучаться с использованием проточного цитометра FACSCaliburTM с аргоновым лазером 488 нм для сбора данных прямого рассеяния (FSC), бокового рассеяния (SSC) и интенсивности флуоресценции йодида пропидия (PLA-2) из ​​2000 событий. Данные будут проанализированы с использованием программного обеспечения CELLQUEST и программы MODFIT, определяя процент клеток в фазах G0/G1, G2/M и S.

Переменная будет выражена в %

Для изучения способности к миграции клеток мы также будем использовать четвертый пассаж культивируемых остеобластов (на 21 день культивирования). Клетки высеивают в 6-луночные культуральные планшеты с плотностью 5×104 клеток на лунку и инкубируют в течение 24 часов до достижения 100% слияния. Впоследствии в каждой лунке будут нарисованы 3 параллельные линии с использованием стерильного наконечника пипетки объемом 300 мкл для создания пустых клеточных пространств, а миграция клеток будет наблюдаться через 6, 12 и 24 часа.

Миграцию клеток будут определять с помощью системы анализа изображений MIP-4.5. Используя цифровые изображения каждой лунки через 6, 12 и 24 часа, будут измерены 10 линий разделения/приближения пустых клеточных пространств, а расстояние, пройденное клетками, будет рассчитано по формуле: Расстояние миграции = (A0/ 2) - (Ат/2), где А0 - исходная ширина бесклеточного пространства, Ат - ширина бесклеточного пространства через 6, 12 или 24 часа.

Переменная будет выражена в %

Коэффициенты жизнеспособности клеток остеобластов будут изучены на 14-й день. Клетки будут отделены от флаконов для клеточных культур с использованием 0,05% трипсина (Sigma-Aldrich Quimica SA, Мадрид, Испания) и количественно определены с использованием камеры Нойбауэра. Затем клетки окрашивают трипановым синим для определения коэффициента жизнеспособности клеток.

Переменная будет выражаться в % на 100 мг.