Sběr autogenních částic během operace implantátu

Jakmile bylo analyzováno množství odebrané kosti, použije se 100 mg kosti pro zbývající proměnné studie.

Vzorky kostí se na 15 sekund uloží do gelu 37% kyseliny fosforečné a poté se promyjí velkým množstvím vody, aby se odstranila zbývající kyselina. Následně budou vzorky po nanesení uhlíkového povlaku upevněny na držáky pro zkoumání pod rastrovacím elektronovým mikroskopem.

Po vizualizaci vzorků při 100X budou pořízeny digitální snímky pro analýzu pomocí softwaru pro analýzu obrazu ImageJ.

Nakonec budou hladiny vápníku a fosforu analyzovány pomocí softwaru Inca Microanalysis Systems.

Velikost bude vyjádřena v nm.

Sterilní Eppendorfovy zkumavky obsahující 100 mg odebrané kosti s jedním ze dvou porovnávaných protokolů budou centrifugovány při 217 g po dobu 6 minut. Supernatant se shromáždí a použije ke kvantifikaci BMP-2 a VEGF pomocí soupravy ELISA. Postup bude proveden podle protokolu poskytnutého výrobcem. Absorbance při 405 nm bude měřena pomocí čtečky ELISA typu EXL-800.

Proměnná bude vyjádřena v % na 100 mg

Pro srovnání morfologie a počtu osteoblastů v kosti odebrané během sekvence mletí se dvěma porovnávanými protokoly se 100 mg kosti okamžitě kultivuje v α-MEM doplněném fetálním bovinním sérem a 1% antibiotikem (penicilin 10 000 U/ml a streptomycin 10 000 ug/ml) Kultivační médium se bude měnit každé 3 dny.

Morfologie a počet kultivovaných osteoblastů bude sledován po 7 a 14 dnech. Po vizualizaci pod 40X optickým mikroskopem bude morfologie popsána jako normální nebo abnormální.

Proměnná bude vyjádřena v % na 100 mg

Pro srovnání možné přítomnosti precipitovaných kalciových uzlů v buněčné kultuře osteoblastů po odběru kosti během sekvence mletí se dvěma porovnávanými protokoly použijeme čtvrtou pasáž kultivovaných osteoblastů (při 21 dnech kultivace). Buňky budou promyty PBS, fixovány 75% studeným ethanolem po dobu 1 hodiny a inkubovány s 1 ml 0,1% alizarinové červeně při pH 8,3 (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Španělsko) po dobu 10 minut. Pak, pokud tam jsou vysrážené kalciové uzliny, budou obarveny červeně a pozorovány pod optickým mikroskopem. Nakonec použijeme roztok 20% methanolu a 10% kyseliny octové na 10 minut k rozpuštění alizarinové červeně. Výsledky budou vyjádřeny kvalitativně měřením absorbance při 550 nm pomocí čtečky ELISA typu EXL-800.

Proměnná bude vyjádřena v %

Použijeme také čtvrtou pasáž kultivovaných osteoblastů (při 21 dnech kultivace). Buňky budou nasazeny na 96jamkové kultivační destičky v hustotě 1 x 103 buněk na jamku. Buněčná proliferace bude hodnocena po 2, 6 a 12 dnech inkubace pomocí testu 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium bromidu (MTT). Nejprve se do média přidá 20 ul MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Španělsko) a inkubuje se po dobu 4 hodin. Následně odebereme médium a do každé jamky přidáme 150 µl dimethylsulfoxidu (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Španělsko). Výsledky budou analyzovány měřením absorbance při 490 nm.

Proměnná bude vyjádřena v %

Pro studium buněčného cyklu použijeme i čtvrtou pasáž kultivovaných osteoblastů (při 21 dnech kultivace). Buňky se oddělí od kultivačních lahví s použitím 0,05% trypsinu (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Španělsko) a 0,02% EDTA. Poté budou promyty a suspendovány v PBS pro analýzu buněčného cyklu. Buňky budou inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut se 100 ml RNázy (1 mg/ml) a 100 ml propidium jodidu.

Obsah DNA v obarvených buňkách bude studován pomocí průtokového cytometru FACSCaliburTM s 488 nm argonovým laserem pro sběr dat dopředného rozptylu (FSC), bočního rozptylu (SSC) a intenzity fluorescence propidium jodidu (PLA-2) z 2000 událostí. Data budou analyzována pomocí softwaru CELLQUEST a programu MODFIT, přičemž se určí procento buněk ve fázích G0/G1, G2/M a S.

Proměnná bude vyjádřena v %

Pro studium migrační schopnosti buněk použijeme také čtvrtou pasáž kultivovaných osteoblastů (po 21 dnech kultivace). Buňky budou nasazeny na 6-jamkové kultivační destičky v hustotě 5 X 104 buněk na jamku a inkubovány po dobu 24 hodin, aby se dosáhlo 100% konfluence. Následně se do každé jamky nakreslí 3 paralelní čáry pomocí sterilní 300 µl špičky pipety, aby se vytvořily prázdné prostory pro buňky, a migrace buněk bude pozorována po 6, 12 a 24 hodinách.

Migrace buněk bude stanovena pomocí systému analýzy obrazu MIP-4.5. Pomocí digitálních snímků každé jamky po 6, 12 a 24 hodinách bude změřeno 10 linií separace/přiblížení prázdných buněčných prostorů a vzdálenost, kterou buňky urazí, bude vypočtena pomocí vzorce: migrační vzdálenost = (A0/ 2) - (At/2), kde A0 je počáteční šířka prostoru bez buněk a At je šířka prostoru bez buněk v 6, 12 nebo 24 hodinách.

Proměnná bude vyjádřena v %

Poměry buněčné životaschopnosti osteoblastů budou studovány 14. den. Buňky budou separovány z kultivačních lahví s použitím 0,05% trypsinu (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Španělsko) a kvantifikovány pomocí Neubauerovy komory. Poté se buňky obarví trypanovou modří, aby se určil poměr životaschopnosti buněk.

Proměnná bude vyjádřena v % na 100 mg