転移性乳がんにおけるナチュラルキラー細胞耐性におけるCCR4-NOT複合体サブユニット7発現の関与 (CCR4-NOT)

1. はじめに 1.1. 研究の問題。 乳がん (BC) は、女性のがんによる死亡の主な原因です (1、2)。 この死亡率の主な原因は、他の臓器への転移です(3)。 転移は、腫瘍細胞が浸潤性の特徴を獲得し (4)、抗腫瘍免疫から逃れる能力を獲得すると発生します。腫瘍制御にとって重要な自然免疫応答と適応免疫応答 (5,6)。 BC の進行には、末梢血ナチュラルキラー (NK) 細胞の成熟と細胞毒性機能の重大な障害が伴うことが報告されています (7)。 いくつかの遺伝子発現プロファイリング研究では、より良い結果は NK 細胞を含む強力な細胞傷害性浸潤と関連していることが示されています (8,9)。 これらのデータは、BC の進行が NK 細胞、T 細胞、および B 細胞の抗腫瘍免疫効率に関連していることを示唆しています。 しかし、BC の進行が末梢 NK 細胞の表現型にどのような影響を与えるかについては十分に研究されていません。

NK細胞の活性は、標的細胞（ここでは腫瘍細胞）認識中に誘発され、それぞれ正または負の細胞シグナル伝達経路を誘導する、NK細胞上に存在する活性化受容体および阻害性受容体によって決定されます。 これらの反対のシグナルの統合により、NK 細胞活性化の重みが決定されます (10)。 最近の研究では、腫瘍微小環境 (TME) でよく見られるいくつかの分子、特に阻害因子が NK 細胞の表現型と機能を著しく損なう可能性があることが示されています (11,12)。その結果、活性化 NK 細胞受容体の発現が減少し、活性化 NK 細胞受容体の発現が増加します。抑制性受容体（HCC の臨床血液サンプル、T 細胞傷害性細胞で以前に検出された LAIR-1 など） (13)。 これらはBCの進行を促進する可能性があり、NK細胞およびT細胞またはB細胞が遭遇する免疫細胞の細胞傷害機能の低下と相関すると考えられます(14)。

1.2. 目的と目的。 BC転移における免疫細胞抵抗性に関連するCNOT7の役割を調査するために、研究者らは、臨床病理学的パラメータと関連してエジプト女性BC患者コホートにおけるCNOT7の血清レベルを測定することを試みた。 転移性腫瘍と非転移性腫瘍として分類されたBC組織サンプルにおけるCNOT7組織発現を、隣接する非腫瘍組織の縁とともに測定した。 さらに、NK 細胞上の抑制性受容体を定量化しました。 LAIR-1 血清レベル。その過剰発現は、TNM として現れる悪性度の BC の特徴および有害な臨床転帰に関連すると考えられます (22)。 CNOT7 と LAIR-1 血中濃度との相関関係は、臨床的に評価され、バイオインフォマティクス データベースの検索やインシリコ解析を通じて確認または展開される予定です。 研究者らは、CNOT7またはLAIR1の血中濃度を調査するだけでなく、BC転移メカニズムを模索しているため、CNOT7分子ドッキングまたはその下流経路またはエフェクター遺伝子-遺伝子ネットワーク相互作用の遮断を通じて、より多くの治療選択肢を見つけることが可能性として期待されているとしている。治療の選択肢。 これらの経路と相互作用は、KEGG 経路検索から取得され、テキストマイニングされた相互作用または厳選された in silico バイオインフォマティクス DB の検索を通じてさらに対処されます。

2.1. 研究参加者 2.1.1. 参加するには倫理的な承認とインフォームドコンセントが必要です。 アイン・シャムス大学薬学部の審査委員会研究倫理委員会から倫理的承認を得ました（REC ID# 48、2021年10月20日）。

2.1.2. この研究は、ヒトを対象とした医学研究に関するヘルシンキ倫理原則宣言（2018年7月改訂版）を満たす世界医師会（WMA）のガイドラインに従って実施され、参加者全員が倫理的に承認されたインフォームド・コンセント（IC）に署名した。

2.1.3. BC州患者団体。 この研究にボランティアとして参加した90人の女性BC患者は、原発性未処理(非転移性)浸潤性BC(患者46名)または転移性BC(患者44名)のいずれかであると診断された。 患者は、IC に署名した後、エジプトのマンスーラにあるマンスーラ大学のマンスーラ大学病院医学部臨床腫瘍科からランダムに登録されました。

2.1.4. BC 診断はマンモグラムと磁気共鳴画像法 (MRI) で実施されました。 すべての研究参加者 (n = 90) の全病歴が収集および記録されました。

対象基準を満たし、IC に署名した人から血液サンプルと組織パラフィンブロックが収集されました。

2.1.5. 患者の臨床的および病理学的特徴。 すべてのBC参加者について、患者の糖尿病の状態（はいまたはいいえ）、妊娠数（2人未満または2人以上）、閉経状態（前か後）、および受けた治療（術前化学療法、補助化学療法、内分泌療法、または乳房切除術）。 患者の個々の現在のがんの状態と腫瘍の臨床評価。マンスーラ大学医学部附属病院で行われ、第 8 版米国がん合同委員会による腫瘍・リンパ節転移 (TNM) 分類を使用しています ( AJCC) 病期分類マニュアルと、BC 外科的探索/検査時に生検が行われた後、患者のデータ ファイルから収集された組織学的等級付け用のブルーム リチャードソン スケール (24)。

免疫組織化学 (IHC) の結果、増殖指数 Ki-67 (低いか高い)、エストロゲン受容体 (ER)、プロゲステロン受容体 (PR) の状態、およびヒト表皮成長受容体 2 (HER2/neu) (それぞれ陽性または陽性のいずれか)陰性）、体格指数（BMI） kg/m2（正常、過体重、肥満 18.5 ～ 24.9、 それぞれ25〜29.9、および≧30 kg/m2）（25）、リンパ節（LN）の状態（なし、N0、N1〜3、N4〜9、≧10）（26）、および年齢（歳）がすべて収集されました。患者のファイルから収集し、統計分析のために表にまとめました。

分子性BCサブタイプ（27） 内腔様（ER+および/またはPR+）、HER-2過剰発現（ER-、PR-、HER-2+）、またはトリプルネガティブBC（TNBC）（ER-、PR-、HER）の場合-2-) および浸潤性乳管癌 (IDC) かどうかに関係なく、組織学的 BC サブタイプ (28) がすべて相関分析のために記録されました。

3. 方法 3.1. 生化学分析 3.1.1. ELISA 3.1.1.1。 ＣＮＯＴ７ ＥＬＩＳＡ ＣＮＯＴ７は、ヒトＣＣＲ４ ＮＯＴ転写複合体サブユニット７（ＣＮＯＴ７）ＥＬＩＳＡキット、Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、米国を製造業者の指示に従って使用して評価した。 簡単に説明すると、非転移性 BC グループと転移性 BC グループの両方の標準サンプルと血清サンプルを、製造元が提供する抗 CNOT7 抗体プレコート ELISA プレート内で CNOT7-HRP コンジュゲートとともに 37℃で 1 時間インキュベートしました。 インキュベーション期間後、ウェルをデカントし、製造元が提供する予め希釈した洗浄緩衝液を使用して手動で５回洗浄した。 ウェルをHRP酵素の基質とともに37℃で1時間インキュベートした。 最後に、停止溶液を添加して反応を停止させた。 生成された色の強度は、マイクロプレートリーダーで 450 nm で分光測光的に測定されました。 色の強度 (光学濃度 (O.D.)) を標準物質の濃度に関連付けて標準曲線をプロットしました。 各サンプルの CNOT7 濃度は、この標準曲線から補間されました (補足ファイル)。

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 は、米国 Mybiosource の Human LAIR-1 ELISA キットを使用して評価されました。 標準およびサンプルを、製造元が提供する LAIR-1 特異的抗体でプレコートされた ELISA プレートのウェルにピペットで移しました。 次いで、プレートを覆い、37℃で45分間インキュベートした。 続いて、事前に希釈した洗浄バッファーを使用して手動で洗浄ステップを 5 回行います。 HRP結合検出抗体をプレートに添加し、同じ温度で30分間再度インキュベートしました。 その後、プレートを前述のように洗浄し、色原体溶液とともに 15 分間インキュベートしました。 続いて、停止液を添加する最終ステップが続きます。 色の強度は、マイクロプレートリーダーで450 nmで分光測光的に測定されました。 標準曲線は、色の強度 (O.D.) を標準物質の濃度に関連付けてプロットされます。 各サンプルの LAIR-1 濃度は、この標準曲線から補間されました (補足ファイル)。 標準は、ストック溶液と、2 倍希釈シリーズ 3.1.1.3 を製造する製造業者によって提供された標準希釈剤から調製されました。 s.インスリンELISA 血清インスリンアッセイは、米国フロリダ州マイアミのHyperion Inc.のELISAキットを使用して実施した。 テストサンプルの色の強度は、そのインスリン濃度に直接反比例します。 成人の正常なインスリン範囲レベルは 0 ～ 25 mU/L です。

3.1.2. 免疫組織化学 3.1.2.1。 CNOT7 IHC 染色プロトコル アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体 (ABC) 技術を使用して、正に帯電したスライドにマウントされたパラフィン切片を使用します (29)。 各グループの切片を 1:25 希釈の CNOT7 (M01) (ABNOVA、カタログ番号 H00029883-M01、モノクローナル抗体、クローン 2F6) で処理した後、ABC 法に必要な化学薬品 (Vectastain ABC-HRP キット、Vector) に曝露しました。研究室)。 抗原抗体複合体を検出するために、マーカー発現をペルオキシダーゼでタグ付けし、ジアミノベンジジン（DAB、Sigma社製）で着色した。 一次抗体または二次抗体の代わりに非免疫血清を使用した陰性対照を含めました。 Leica 顕微鏡 (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems、スイス) を使用して、IHC 染色切片を評価しました (Leica Microsystems、スイス)。

3.1.2.2. CNOT7 IHC 結果「面積 %」の定量的評価 分析された患者グループの各連続切片において、褐色免疫染色陽性の 6 つの高倍率視野 (x 400) が検査のために選択されました。 CNOT7染色切片の面積%は、Leica QWin 500画像分析コンピュータシステム(英国)を使用して計算した。 この画像解析装置には、ライカ顕微鏡、カラー ビデオ カメラ、カラー モニタ、および顕微鏡にリンクされ、ライカ QWin 500 ソフトウェアによって管理されるライカ IBM パーソナル コンピュータのハードディスクが必要でした。

面積%データは、4つの非転移性サンプルと4つの転移性サンプルからの8つの画像について、平均および平均の標準誤差(平均±S.E.M)に関して統計的に報告されました。

3.2. インシリコバイオインフォマティクス分析 3.2.1。 乳がん遺伝子発現マイナー v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) 2023 年 6 月 28 日に更新されました。

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) を参照して、CNOT7 と LAIR1 の間の相関関係を調べます。

3.2.2. 遺伝子セット濃縮分析 (GSEA) による遺伝子オントロジー生物学的プロセス (GO_BP) の分析を実行するために使用される LinkedOmics の機能モジュール http://www.linkedomics.org/ (31)。

3.2.3. インシリコでキュレーションされた DB とテキストマイニングからの遺伝子間の相互作用と経路 カリフォルニア大学サンタクルーズ校 (UCSC) を使用したターゲット遺伝子のゲノムブラウザ経由 (32) ゲノミクス研究所 http://genome.ucsc.edu/index.html LAIR1 と CNOT7 遺伝子の相互作用が検索され、DrugBank から既知の阻害薬について言及されました。

3.2.4. Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) データベース バージョン 11.5 https://string-db.org/ のタンパク質間相互作用 (PPI)。関連する実験データ、配列決定結果、および文献に基づいて相互作用を予測します。 >1100 を超える完全に配列決定された生物 (33)。 LAIR-1 相互作用タンパク質を調査するために、2023 年 1 月 20 日にアクセスされました。

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5。 正常組織と腫瘍組織にわたる遺伝子発現パターン (GENT2) を生存期間とともに探索する http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. 分子ドッキング: 3.3.1。 LAIR-1 および CNOT7 のタンパク質構造の調製 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 タンパク質データ バンク (PDB) より https:// www.rcsb.org/Human LAIR-1 の結晶構造を検索 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structural/3RP1 分子動作環境 (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm に構造をロードした後 統合コンピュータ支援分子設計プラットフォームでは、水分子の除去、タンパク質構造への水素原子の追加、プロトン化状態の調整、Amber10 によるタンパク質構造のエネルギー最小化の確保など、「QuickPrep パネル」のデフォルト パラメータを使用して調製されました。 :EHT 力場。

これらの結晶構造はリガンドと共結晶化していないため、MOE に搭載されている結合部位解析プログラム MOE SiteFinder を使用して結合部位の予測を行いました。 これらのポケットは、リガンド結合の傾向 (PLB) に基づいてランク付けされます。 CNOT7 は、利用可能な PDB 共結晶化構造を持たない受容体であるため、研究者らは、Glu247 などのリガンドと CNOT7 タンパク質の相互作用に関与するいくつかの必須アミノ酸残基を報告している以前の文献のガイドとともに、MOE siteFinder ツールを使用して研究を支援しました。 Tyr260、Glu278 (34、35) は比較的重要であることが確認されています。

3.3.2. リガンド データセットのキュレーション MOE に実装された「ビルダー プログラム」は、研究で 6 つのリガンドをモデル化するために使用されました。ビタミン E、コルヒチン、プロディジオシン、リボフラビン、テルミサルタン、およびピオグリタゾン。生理学的 pH で考えられるすべての立体構造が得られました。

3.3.3. ドッキングシミュレーション MOE プログラムの配置および洗練アルゴリズムを使用して、得られた 6 つのリガンドの立体構造のドッキングを実行しました。 活性部位における分子の最初のドッキングには、「Triangle Matcher」配置法と「London dG」スコアリング関数を使用しました。 「GBVI/WSA dG」スコアリング方法を使用して、ドッキング ポーズの配置後のさらなる改良が実現されました。 最小エネルギーのポーズは、結合相互作用および受容体の結合部位の占有を視覚化するために使用されました。

3.4. 統計分析 3.4.1. 収集されたデータは、社会科学統計パッケージ ソフトウェア (SPSS、バージョン 17、米国イリノイ州シカゴ) を使用して記録および分析されました。

3.4.2. 定性的データは頻度 (n) とパーセンテージ (%) として表示されました。 3.4.3. 定量的データの正規性のテストは、Shapiro-Wilk 計算機を使用して実行されました。 正規分布変数は平均±S.E.Mとして表され、2つのグループの比較のために2つのサンプル独立したスチューデントのt検定を使用して分析されました。 正規分布していないデータは中央値 (四分位範囲は第 1 四分位から第 3 四分位まで、または第 25 四分位から第 75 四分位まで) として提示され、マン-ホイットニー (U) 検定を使用して分析されました。

3.4.4. ROC 曲線を実行して、CNOT7 および LAIR-1 の血清レベルを低発現サブグループと高発現サブグループに分類するための最良のカットオフ ポイントを検出しました。

3.4.5. カイ二乗検定を使用して、CNOT7 血清レベルと臨床病理学的パラメーターの間の関連性を評価しました。 ピアソン相関検定を使用して、パラメトリック変数間の関連性を評価しました。 パラメータの 1 つが二値変数である場合、点双系列相関を使用してパラメータ間の相関を決定しました。

3.4.6. 有意水準は P< 0.05、信頼水準 (C.I) または区間はそれぞれ 95% と 5% に設定されました。