Implication de l'expression de la sous-unité 7 du complexe CCR4-NOT dans la résistance des cellules tueuses naturelles dans le cancer du sein métastatique (CCR4-NOT)

1. Introduction 1.1. Problème de recherche. Le cancer du sein (BC) est la principale cause de décès par cancer chez les femmes (1,2). La principale cause de cette mortalité est la propagation métastatique à d’autres organes (3). Les métastases se produisent lorsque les cellules tumorales acquièrent des caractéristiques invasives (4) et la capacité d'échapper à l'immunité antitumorale ; réponses immunitaires innées et adaptatives importantes pour le contrôle des tumeurs (5,6). Une altération majeure de la maturation des cellules tueuses naturelles (NK) du sang périphérique et des fonctions cytotoxiques accompagnerait la progression de la Colombie-Britannique (7). Plusieurs études de profilage de l'expression génique ont montré qu'un meilleur résultat est associé à un fort infiltrat cytotoxique contenant des cellules NK (8,9). Ces données suggèrent que la progression de la Colombie-Britannique est liée à l'efficacité immunitaire antitumorale des cellules NK, des cellules T et des cellules B. Cependant, la manière dont la progression de la Colombie-Britannique affecte le phénotype des cellules NK périphériques n’a pas été étudiée de manière approfondie.

L'activité des cellules NK est déterminée par l'activation et l'inhibition des récepteurs présents sur les cellules NK qui sont déclenchés lors de la reconnaissance des cellules cibles (ici, des cellules tumorales), induisant respectivement une voie de signalisation cellulaire positive ou négative. L'intégration de ces signaux opposés détermine le poids d'activation des cellules NK (10). Des études récentes ont montré que plusieurs molécules, notamment des facteurs inhibiteurs, souvent présentes dans le microenvironnement tumoral (TME), peuvent altérer fortement le phénotype et les fonctions des cellules NK (11, 12), entraînant une diminution de l'expression des récepteurs activants des cellules NK et une expression accrue de les récepteurs inhibiteurs (comme LAIR-1 qui a été détecté précédemment dans des échantillons sanguins cliniques de CHC, cellules T-cytotoxiques (13). Ceux-ci pourraient favoriser la progression de la Colombie-Britannique et seraient en corrélation avec la diminution de la fonction cytotoxique des cellules immunitaires rencontrée par les cellules NK et les cellules T ou B (14).

1.2. But et objectifs. Pour explorer le rôle de CNOT7 lié à la résistance des cellules immunitaires dans les métastases de la Colombie-Britannique, les enquêteurs ont tenté de mesurer les taux sériques de CNOT7 dans la cohorte de patientes égyptiennes de la Colombie-Britannique par rapport aux paramètres clinicopathologiques. L'expression tissulaire de CNOT7 dans des échantillons de tissus de Colombie-Britannique classés comme tumeurs métastatiques ou non métastatiques ainsi que la marge de tissu non tumoral adjacente ont été mesurées. En outre, nous avons quantifié le récepteur inhibiteur sur les cellules NK, à savoir ; Taux sériques de LAIR-1, dont la surexpression serait liée aux caractéristiques agressives de la Colombie-Britannique et aux résultats cliniques indésirables (22) se manifestant par un TNM. La corrélation de CNOT7 avec les taux sanguins de LAIR-1 doit être évaluée cliniquement et être confirmée ou déployée via la recherche dans des bases de données bioinformatiques et l'analyse in silico. Selon les enquêteurs, ils recherchent le mécanisme des métastases de la Colombie-Britannique, et ne se contentent pas d'explorer les taux sanguins de CNOT7 ou de LAIR1. Par conséquent, ils trouvent davantage d'options thérapeutiques, via l'amarrage moléculaire de CNOT7 ou en bloquant ses voies en aval ou l'interaction des réseaux de gènes effecteurs, soit comme potentiel prometteur. options de traitement. Où, ces voies et interactions seront récupérées à partir de la recherche de voies KEGG, puis abordées via des interactions textuelles ou une recherche dans des bases de données bioinformatiques organisées in silico.

2.1. Participants à l'étude 2.1.1. Approbation éthique et consentement éclairé pour participer. L'approbation éthique a été obtenue du comité d'éthique de la recherche du comité d'examen de la faculté de pharmacie de l'université Ain Shams (REC ID n° 48, 20 octobre 2021).

2.1.2. L'étude a été réalisée conformément aux lignes directrices de l'Association médicale mondiale (WMA) respectant les principes éthiques de la Déclaration d'Helsinki pour la recherche médicale impliquant des sujets humains, la version révisée de juillet 2018, dans laquelle toutes les personnes participantes ont signé le consentement éclairé (IC) éthiquement approuvé.

2.1.3. Groupes de patients de la Colombie-Britannique. 90 patientes de Colombie-Britannique, volontaires dans l'étude, ont reçu un diagnostic de BC invasive primaire naïve (non métastatique) (46 patientes) ou de BC métastatique (44 patients). Les patients ont été recrutés au hasard dans le département d'oncologie clinique, la faculté de médecine, les hôpitaux universitaires de Mansoura, l'université de Mansoura, Mansoura, Égypte, après avoir signé le CI.

2.1.4. Le diagnostic de BC a été réalisé par mammographie et imagerie par résonance magnétique (IRM). L'historique complet a été collecté et enregistré pour tous les participants à l'étude (n = 90).

Des échantillons de sang et des blocs de paraffine tissulaire ont été prélevés pour ceux qui répondaient aux critères d'inclusion et signaient le CI.

2.1.5. Caractéristiques cliniques et pathologiques des patients. Pour tous les participants de Colombie-Britannique, les antécédents familiaux complets de maladie/cancer ont été enregistrés, ainsi que le statut diabétique des patientes (oui ou non), le nombre de grossesses (inférieur ou supérieur à 2), l'état ménopausique (avant ou après) et traitement(s) reçu(s) (chimiothérapie néoadjuvante, chimiothérapie adjuvante, endocrinothérapie ou mastectomie). L'état actuel du cancer des patients et l'évaluation clinique de la tumeur, réalisée à la Faculté de médecine de l'hôpital universitaire de Mansoura, Université de Mansoura, en utilisant la catégorisation des métastases ganglionnaires tumorales (TNM) selon la 8e édition de l'American Joint Committee on Cancer ( AJCC) et l'échelle de Bloom-Richardson pour le classement histologique (24) collectées à partir des dossiers de données des patients, après qu'une biopsie ait été réalisée au moment de l'exploration/examen chirurgical en Colombie-Britannique.

Résultats d'immunohistochimie (IHC) pour l'indice de prolifération Ki-67 (faible ou élevé), le statut du récepteur des œstrogènes (ER), du récepteur de la progestérone (PR) et du récepteur de croissance épidermique humaine 2 (HER2/neu) (chacun étant positif ou positif). négatif), indice de masse corporelle (IMC) kg/m2 (normal, surpoids et obèse 18,5-24,9, 25-29,9 et ≥30 kg/m2, respectivement) (25), le statut des ganglions lymphatiques (LN) (aucun N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) et l'âge en années, ont tous été collectés. à partir des dossiers des patients et compilés pour une analyse statistique.

Sous-type de BC moléculaire (27) si type luminal (ER+ et/ou PR+), surexpression de HER-2 (ER-, PR-, HER-2+) ou BC triple négatif (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) et les sous-types histologiques de BC (28), qu'ils soient carcinomes canalaires invasifs (IDC) ou non, ont tous été enregistrés pour une analyse de corrélation.

3. Méthodes 3.1. Analyse biochimique 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 a été évalué à l'aide du kit ELISA de la sous-unité 7 du complexe de transcription Human CCR4 NOT (CNOT7), Mybiosource, USA, en suivant les instructions du fabricant. En bref, les standards et les échantillons de sérum des groupes BC non métastatiques et métastatiques ont été incubés avec le conjugué CNOT7-HRP dans une plaque ELISA pré-enduite d'anticorps anti-CNOT7 fournie par le fabricant pendant une heure à 37°C. Après la période d'incubation, les puits ont été décantés et lavés cinq fois manuellement à l'aide d'un tampon de lavage prédilué fourni par le fabricant. Puits incubés avec un substrat pour l'enzyme HRP pendant une heure à 37°C. Enfin, une solution d'arrêt a été ajoutée pour arrêter la réaction. L'intensité de la couleur produite a été mesurée par spectrophotométrie à 450 nm dans un lecteur de microplaques. Une courbe d'étalonnage a été tracée reliant l'intensité de la couleur (densité optique (OD)) à la concentration d'étalons. La concentration de CNOT7 dans chaque échantillon a été interpolée à partir de cette courbe standard (fichier supplémentaire).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 a été évalué à l'aide du kit Human LAIR-1 ELISA, Mybiosource, USA. Les standards et les échantillons ont été pipetés dans les puits d'une plaque ELISA pré-revêtue d'un anticorps spécifique LAIR-1 fourni par le fabricant. La plaque a ensuite été recouverte et incubée à 37°C pendant 45 min. suivi d'une étape de lavage manuel 5 fois à l'aide d'un tampon de lavage préalablement dilué. Un anticorps de détection conjugué à la HRP a été ajouté à la plaque et celui-ci a été à nouveau incubé à la même température pendant 30 min. Ensuite, la plaque a été lavée comme expliqué précédemment et incubée avec des solutions de chromogène pendant 15 min. suivie d'une étape finale d'ajout de solution d'arrêt. L'intensité de la couleur a été mesurée par spectrophotométrie à 450 nm dans un lecteur de microplaques. Une courbe d'étalonnage est tracée reliant l'intensité de la couleur (OD) à la concentration d'étalons. La concentration de LAIR-1 dans chaque échantillon a été interpolée à partir de cette courbe standard (fichier supplémentaire). Les étalons ont été préparés à partir d'une solution mère et d'un diluant étalon fourni par le fabricant, produisant une série de dilutions de 2 fois. 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Le dosage de l'insuline sérique a été réalisé à l'aide du kit ELISA de Hyperion Inc., Miami, FL, USA. L’intensité de la couleur de l’échantillon testé est directement inversement liée à sa concentration en insuline. Le niveau normal d’insuline pour adultes est compris entre 0 et 25 mU/L.

3.1.2. Immunohistochimie 3.1.2.1. Protocole de coloration CNOT7 IHC Utilisation de coupes en paraffine montées sur des lames chargées positivement en utilisant la technique du complexe avidine-biotine-peroxydase (ABC) (29). Les coupes de chaque groupe ont été traitées avec CNOT7 (M01) (ABNOVA, Cat# H00029883-M01, Anticorps monoclonal, Clone 2F6) à une dilution de 1:25 avant d'être exposées aux produits chimiques nécessaires à la méthode ABC (kit Vectastain ABC-HRP, Vector laboratoires). Pour détecter les complexes antigène-anticorps, l'expression du marqueur a été marquée avec de la peroxydase et colorée avec de la diaminobenzidine (DAB, fabriqué par Sigma). Les contrôles négatifs ont été inclus en utilisant du sérum non immun à la place des anticorps primaires ou secondaires. Le microscope Leica (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Suisse) a été utilisé pour évaluer les coupes colorées IHC (Leica Microsystems, Suisse).

3.1.2.2. Évaluation quantitative des résultats CNOT7 IHC « Zone % » Dans chaque section en série des groupes de patients analysés, six champs de puissance élevée (x 400) avec immunocoloration brune positive ont été choisis pour examen. Le pourcentage de surface des coupes colorées au CNOT7 a été calculé à l'aide du système informatique analyseur d'images Leica QWin 500 (Royaume-Uni). Cet analyseur d'images comprenait un microscope Leica, une caméra vidéo couleur, un moniteur couleur et un disque dur d'un ordinateur personnel Leica IBM relié au microscope et géré par le logiciel Leica QWin 500.

Les données en% de zone ont été rapportées statistiquement en termes de moyenne et d'erreur type de moyenne (moyenne ± S.E.M) pour huit images provenant de quatre échantillons non métastatiques et de quatre échantillons métastatiques.

3.2. Analyse bioinformatique in silico 3.2.1. Cancer du sein Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Mis à jour le 28 juin 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) pour explorer la corrélation entre CNOT7 et LAIR1.

3.2.2. Module fonctionnel de LinkedOmics utilisé pour effectuer l'analyse du processus biologique Gene Ontology (GO_BP) avec analyse d'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Interactions et voies gène-gène à partir de bases de données organisées in silico et d'exploration de texte via Genome Browser pour les gènes cibles à l'aide de l'Université de Californie à Santa Cruiz (UCSC) (32) Institut de génomique http://genome.ucsc.edu/index.html Les interactions des gènes LAIR1 et CNOT7 ont été récupérées, en mentionnant les médicaments inhibiteurs connus de DrugBank.

3.2.4. Interaction protéine-protéine (PPI) de la base de données de l'outil de recherche pour la récupération des gènes/protéines en interaction (STRING) version 11.5 https://string-db.org/ qui prédit les interactions sur la base de données expérimentales pertinentes, de résultats de séquençage et de la littérature de > 1 100 organismes entièrement séquencés (33). Consulté le 20 janvier 2023 pour explorer les protéines interagissant avec LAIR-1.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Exploration des modèles d'expression génique dans les tissus normaux et tumoraux (GENT2) avec survie http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Amarrage moléculaire : 3.3.1. Préparation des structures protéiques de LAIR-1 et CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 De la banque de données sur les protéines (PDB) https:// www.rcsb.org/search la structure cristalline de Human LAIR-1 (PDB ID : 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Après avoir chargé les structures dans un environnement d'exploitation moléculaire (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Plateforme intégrée de conception moléculaire assistée par ordinateur, ils ont été préparés en utilisant les paramètres par défaut du « QuickPrep Panel », notamment l'élimination des molécules d'eau, l'ajout d'atomes d'hydrogène à la structure protéique, l'ajustement des états de protonation et la garantie d'une minimisation énergétique des structures protéiques avec Amber10. : Champ de force EHT.

Étant donné que ces structures cristallines n'étaient co-cristallisées avec aucun ligand, MOE SiteFinder, un programme d'analyse des sites de liaison équipé dans le MOE, a été utilisé pour prédire les sites de liaison possibles. Ces poches sont classées en fonction de leur propension à la liaison du ligand (PLB). CNOT7 est un récepteur sans structure co-cristallisée PDB disponible, par conséquent, les enquêteurs ont utilisé l'outil MOE siteFinder pour nous aider dans notre étude, avec le guide des littératures précédentes rapportant plusieurs résidus d'acides aminés essentiels impliqués dans les interactions ligand-protéine CNOT7 comme Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) ont été identifiés comme relativement importants.

3.3.2. Conservation de l'ensemble de données sur les ligands Le « programme de construction » mis en œuvre dans MOE a été utilisé pour modéliser six ligands dans l'étude ; Vitamine E, Colchicine, Prodigiosine, Riboflavine, Telmisartan et Pioglitazone, où toutes les conformations possibles au pH physiologique ont été obtenues.

3.3.3. Simulations d'amarrage L'amarrage des conformations obtenues des six ligands a été réalisé à l'aide des algorithmes de placement et de raffinement du programme MOE. L'amarrage initial des molécules dans les sites actifs a utilisé la méthode de placement « Triangle Matcher » et la fonction de notation « London dG ». Un affinement ultérieur des poses d'amarrage a été obtenu en utilisant la méthode de notation « GBVI/WSA dG ». Les poses avec une énergie minimale ont été utilisées pour visualiser les interactions de liaison ainsi que l'occupation du site de liaison des récepteurs.

3.4. Analyse statistique 3.4.1. Les données collectées ont été enregistrées et analysées à l'aide du logiciel Statistical Package for Social Science (SPSS, version 17, Chicago, IL, USA).

3.4.2. Les données qualitatives ont été présentées sous forme de fréquences (n) et de pourcentages (%). 3.4.3. Le test de normalité des données quantitatives a été réalisé à l'aide de la calculatrice Shapiro-Wilk. Les variables normalement distribuées ont été représentées sous forme de moyenne ± SEM et analysées à l'aide du test t de Student indépendant de deux échantillons pour la comparaison de deux groupes. Les données non distribuées normalement ont été présentées sous forme de médianes (intervalles interquartiles du premier au troisième quartile ou du 25e au 75e quartile) et analysées à l'aide du test de Mann-Whitney (U).

3.4.4. La courbe ROC a été réalisée pour détecter les meilleurs seuils afin de classer les taux sériques de CNOT7 et de LAIR-1 en sous-groupes d'expression faible et élevée.

3.4.5. Le test du chi carré a été utilisé pour évaluer l'association entre les taux sériques de CNOT7 et les paramètres clinicopathologiques. Le test de corrélation de Pearson a été utilisé pour évaluer l'association entre les variables paramétriques. Des corrélations point-bisériales ont été utilisées pour déterminer la corrélation entre les paramètres lorsque l'un d'eux était une variable dichotomique.

3.4.6. Le niveau de signification a été fixé à P <0,05 et le niveau de confiance (IC) ou intervalle à 95 % et 5 %, respectivement.