전이성 유방암에서 자연살해세포 저항성에 대한 CCR4-NOT 복합체 서브유닛 7 발현의 의미 (CCR4-NOT)

1. 소개 1.1. 연구 문제. 유방암(BC)은 여성의 암 사망의 주요 원인입니다(1,2). 이 사망의 주요 원인은 다른 기관으로의 전이성 확산입니다(3). 전이는 종양 세포가 침습적 특징(4)과 항종양 면역에서 벗어날 수 있는 능력을 획득할 때 발생합니다. 종양 제어에 중요한 선천적 및 적응성 면역 반응(5,6). 말초 혈액 자연 살해(NK) 세포 성숙 및 세포독성 기능의 주요 손상이 BC 진행을 동반하는 것으로 보고되었습니다(7). 여러 유전자 발현 프로파일링 연구에 따르면 더 나은 결과는 NK 세포를 포함하는 강력한 세포독성 침윤물과 연관되어 있는 것으로 나타났습니다(8,9). 이러한 데이터는 BC 진행이 NK 세포, T 세포 및 B 세포의 항종양 면역 효율과 연관되어 있음을 시사합니다. 그러나 BC 진행이 말초 NK 세포 표현형에 어떻게 영향을 미치는지는 풍부하게 조사되지 않았습니다.

NK 세포의 활성은 표적 세포(여기서는 종양 세포) 인식 중에 촉발되어 각각 양성 또는 음성 세포 신호 전달 경로를 유도하는 NK 세포에 존재하는 활성화 수용체와 억제 수용체에 의해 결정됩니다. 이러한 반대 신호의 통합은 NK 세포 활성화 가중치를 결정합니다(10). 최근 연구에 따르면 종양 미세환경(TME)에서 종종 발견되는 여러 분자, 특히 억제 인자가 NK 세포의 표현형과 기능을 급격히 손상시켜(11,12) 활성화하는 NK 세포 수용체의 발현을 감소시키고 NK 세포의 발현을 증가시키는 것으로 나타났습니다. HCC 임상 혈액 샘플에서 이전에 검출된 LAIR-1과 같은 억제 수용체 T-세포독성 세포(13). 이는 BC 진행을 촉진할 수 있으며 NK 세포와 T 세포 또는 B 세포가 직면하는 면역 세포의 세포독성 기능 감소와 상관관계가 있습니다(14).

1.2. 목표와 목적. BC 전이에서 면역 세포 저항성과 관련된 CNOT7 역할을 탐색하기 위해 연구자들은 임상병리학적 매개변수와 관련하여 이집트 여성 BC 환자 집단에서 CNOT7의 혈청 수준을 측정하려고 시도했습니다. 인접한 비종양 조직 마진과 함께 전이성 대 비전이성 종양으로 분류된 BC 조직 샘플에서 CNOT7 조직 발현을 측정했습니다. 또한, NK 세포의 억제 수용체를 정량화했습니다. LAIR-1 혈청 수준은 과발현이 공격적인 BC 특징 및 불리한 임상 결과(들)(22)와 연관되어 TNM으로 나타납니다. CNOT7과 LAIR-1 혈중 농도의 상관관계는 임상적으로 평가되고 생물정보학 데이터베이스 검색 및 인실리코 분석을 통해 확인되거나 출시될 예정입니다. 연구자들은 CNOT7 또는 LAIR1 혈중 농도를 탐색하는 것뿐만 아니라 BC 전이 메커니즘을 찾고 있으므로 CNOT7 분자 도킹을 통해 또는 하위 경로 또는 효과기 유전자-유전자 네트워크 상호 작용을 차단하여 잠재적으로 유망한 것으로 더 많은 치료 옵션을 찾습니다. 치료 옵션. 여기서 이러한 경로와 상호 작용은 KEGG 경로 검색에서 검색되며, 텍스트 마이닝 상호 작용을 통해 추가로 처리되거나 in silico 생물정보학 DB에서 선별된 검색을 통해 처리됩니다.

2.1. 연구 참가자 2.1.1. 참여에 대한 윤리적 승인 및 사전 동의. 아인샴스대학교 약학부 심의위원회 연구윤리위원회로부터 윤리적 승인을 받았습니다(REC ID# 48, 2021년 10월 20일).

2.1.2. 이 연구는 인간 피험자를 대상으로 한 의학 연구에 대한 헬싱키 윤리 원칙 선언(2018년 7월 개정판)을 이행하는 세계의사협회(WMA)의 지침에 따라 수행되었으며, 모든 참여 개인은 윤리적으로 승인된 사전 동의(IC)에 서명했습니다.

2.1.3. BC 환자 그룹. 연구에 자원한 90명의 여성 BC 환자는 원발성 미경험(비전이성) 침습성 BC(46명 환자) 또는 전이성 BC(44명 환자)로 진단되었습니다. 환자들은 IC에 서명한 후 이집트 만수라에 있는 만수라 대학의 만수라 대학 병원 의과대학 임상 종양학과에서 무작위로 등록되었습니다.

2.1.4. BC 진단은 유방조영술과 자기공명영상(MRI)을 통해 시행됐다. 모든 연구 참가자(n = 90)에 대해 전체 이력을 수집하고 기록했습니다.

포함 기준을 충족하고 IC에 서명한 사람들을 위해 혈액 샘플과 조직 파라핀 블록을 수집했습니다.

2.1.5. 환자의 임상적, 병리학적 특징. 모든 BC 참가자에 대해 가족 전체의 질병/암 병력뿐만 아니라 환자의 당뇨병 상태(예 대 아니오), 임신 횟수(2회 미만 또는 그 이상), 폐경기 상태(전-후) 및 받은 치료(신보강 화학요법, 보조 화학요법, 내분비 요법 또는 유방절제술). 미국 암 합동 위원회(American Joint Committee on Cancer) 제8판에 따라 종양-절-전이(TNM) 분류를 사용하여 만수라 대학교 의과대학에서 수행된 환자의 개별 현재 암 상태 및 종양 임상 평가(TNM) AJCC) 병기 결정 매뉴얼 및 조직학적 등급 분류를 위한 Bloom-Richardson 척도(24)는 BC 수술 탐색/검사 시 생검을 실시한 후 환자의 데이터 파일에서 수집되었습니다.

증식 지수 Ki-67(낮음 또는 높음), 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 상태 및 인간 표피 성장 수용체 2(HER2/neu)에 대한 면역조직화학(IHC) 결과(각각 양성 또는 높음) 음성), 체질량지수(BMI) kg/m2(정상, 과체중, 비만 18.5~24.9, 각각 25-29.9 및 ≥30 kg/m2)(25), 림프절(LN) 상태(없음 N0, N1-3, N4-9, ≥ 10)(26) 및 연령(세)이 모두 수집되었습니다. 환자의 파일에서 통계 분석을 위해 표로 작성되었습니다.

관강 유사(ER+ 및/또는 PR+), HER-2 과발현(ER-, PR-, HER-2+) 또는 삼중 음성 BC(TNBC)(ER-, PR-, HER)인 경우 분자 BC 하위 유형(27) -2-) 및 조직학적 BC 아형(28)은 침윤성 관암종(IDC) 여부에 관계없이 모두 상관 분석을 위해 기록되었습니다.

3. 방법 3.1. 생화학적 분석 3.1.1. 엘리사 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7은 제조사의 지침에 따라 Human CCR4 NOT 전사 복합체 서브유닛 7(CNOT7) ELISA 키트(Mybiosource, USA)를 사용하여 평가되었습니다. 간단히 말하면, 비전이성 BC 그룹과 전이성 BC 그룹 모두의 표준 및 혈청 샘플을 제조업체가 제공한 항-CNOT7 항체 사전 코팅된 ELISA 플레이트에서 CNOT7-HRP 접합체와 함께 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 배양 기간 후, 웰을 따라내고 제조업체가 제공한 미리 희석된 세척 완충액을 사용하여 수동으로 5회 세척했습니다. 웰을 HRP 효소 기질과 함께 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 마지막으로 정지용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 생성된 색상 강도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 분광광도계로 측정되었습니다. 표준 농도에 대한 색 강도(광학 밀도(O.D.))와 관련된 표준 곡선을 플롯했습니다. 각 샘플의 CNOT7 농도는 이 표준 곡선(보충 파일)에서 보간되었습니다.

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1은 Human LAIR-1 ELISA Kit(Mybiosource, USA)를 사용하여 평가되었습니다. 표준품과 샘플을 제조사가 공급한 LAIR-1 특이적 항체로 사전 코팅된 ELISA 플레이트의 웰에 피펫으로 넣었습니다. 그런 다음 플레이트를 덮고 37°C에서 45분 동안 배양했습니다. 그 다음에는 이전에 희석한 세척 완충액을 사용하여 5회 수동 세척 단계를 수행합니다. HRP-Conjugated 검출 항체를 플레이트에 첨가하고 동일한 온도에서 30분 동안 다시 배양했습니다. 그 후, 이전에 설명한 대로 플레이트를 세척하고 발색체 용액과 함께 15분 동안 배양했습니다. 정지 솔루션을 추가하는 마지막 단계가 이어집니다. 색상의 강도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 분광 광도계로 측정되었습니다. 색상의 강도(O.D.)와 표준 농도를 연관시키는 표준 곡선이 그려집니다. 각 샘플의 LAIR-1 농도는 이 표준 곡선(보충 파일)에서 보간되었습니다. 표준은 2배 희석 시리즈 3.1.1.3을 생산하는 제조사가 제공한 스톡 용액과 표준 희석제로부터 제조되었습니다. s.인슐린 ELISA 혈청 인슐린 분석은 Hyperion Inc.(Miami, FL, USA) ELISA 키트를 사용하여 수행되었습니다. 테스트 샘플의 색상 강도는 인슐린 농도와 직접적으로 반비례합니다. 정상적인 성인 인슐린 범위 수준은 0-25 mU/L입니다.

3.1.2. 면역조직화학 3.1.2.1. CNOT7 IHC 염색 프로토콜 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체(ABC) 기술을 사용하여 양전하를 띤 슬라이드에 장착된 파라핀 절편을 사용합니다(29). 각 그룹의 절편을 1:25 희석 비율로 CNOT7(M01)(ABNOVA, Cat# H00029883-M01, 단클론 항체, Clone 2F6)로 처리한 후 ABC 방법(Vectastain ABC-HRP 키트, Vector)에 필요한 화학 물질에 노출시켰습니다. 실험실). 항원-항체 복합체를 검출하기 위해 마커 발현에 퍼옥시다제를 태그하고 디아미노벤지딘(DAB, Sigma 제조)으로 착색했습니다. 1차 또는 2차 항체 대신 비면역 혈청을 사용하여 음성 대조군을 포함시켰습니다. Leica 현미경(CH9435 Hee56rbrugg)(Leica Microsystems, 스위스)을 사용하여 IHC 염색된 섹션(Leica Microsystems, 스위스)을 평가했습니다.

3.1.2.2. CNOT7 IHC 결과의 정량적 평가 "면적%" 분석된 환자 그룹의 각 연속 섹션에서 양성 갈색 면역염색이 있는 6개의 고전력 필드(x 400)를 검사를 위해 선택했습니다. CNOT7로 염색된 부분의 면적%는 Leica QWin 500 이미지 분석기 컴퓨터 시스템(UK)을 사용하여 계산되었습니다. 이 이미지 분석기에는 Leica 현미경, 컬러 비디오 카메라, 컬러 모니터 및 현미경에 연결되고 Leica QWin 500 소프트웨어로 관리되는 Leica IBM 개인용 컴퓨터의 하드 디스크가 필요합니다.

면적 % 데이터는 4개의 비전이성 샘플과 4개의 전이성 샘플의 8개 이미지에 대한 평균 및 평균의 표준 오차(평균 ± S.E.M)로 통계적으로 보고되었습니다.

3.2. 인실리코 생물정보학 분석 3.2.1. 유방암 유전자 발현 마이너 v5.0(bc-GenExMiner v5.0) 2023년 6월 28일 업데이트되었습니다.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) CNOT7과 LAIR1 사이의 상관 관계를 탐색합니다.

3.2.2. 유전자 세트 농축 분석(GSEA)을 통해 유전자 온톨로지 생물학적 프로세스(GO_BP) 분석을 수행하는 데 사용되는 LinkedOmics의 기능 모듈 http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. 캘리포니아 대학 산타 크루즈(UCSC)를 사용하여 표적 유전자에 대한 게놈 브라우저를 통해 인실리코 큐레이트된 DB 및 텍스트 마이닝의 유전자-유전자 상호 작용 및 경로(32) Genomics Institute http://genome.ucsc.edu/index.html DrugBank의 알려진 억제제 약물을 언급하면서 LAIR1 및 CNOT7 유전자 상호 작용을 검색했습니다.

3.2.4. 상호 작용 유전자/단백질 검색 도구(STRING) 데이터베이스 버전 11.5 https://string-db.org/의 단백질-단백질 상호 작용(PPI)은 관련 실험 데이터, 시퀀싱 결과 및 문헌을 기반으로 상호 작용을 예측합니다. >1100개의 완전 서열화된 유기체(33). LAIR-1 상호작용 단백질을 탐색하기 위해 2023년 1월 20일에 액세스했습니다.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. 생존이 있는 정상 및 종양 조직(GENT2) 전반의 유전자 발현 패턴 탐색 http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. 분자 도킹: 3.3.1. LAIR-1 및 CNOT7의 단백질 구조 준비 https://www.protocols.io/view/단백질-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 https:// www.rcsb.org/search Human LAIR-1의 결정 구조(PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 분자 작동 환경(MOE)에서 구조를 로딩한 후 https://www.chemcomp.com/Products.htm 통합 컴퓨터 지원 분자 설계 플랫폼은 물 분자 제거, 단백질 구조에 수소 원자 추가, 양성자화 상태 조정, Amber10을 사용한 단백질 구조의 에너지 최소화 보장 등 'QuickPrep 패널'의 기본 매개변수를 사용하여 준비되었습니다. :EHT 역장.

이들 결정 구조는 어떠한 리간드와도 공결정화되지 않았으므로 MOE에 구비된 결합 부위 분석 프로그램인 MOE SiteFinder를 사용하여 가능한 결합 부위를 예측하였다. 이러한 포켓은 리간드 결합(PLB) 성향을 기준으로 순위가 매겨집니다. CNOT7은 이용 가능한 PDB 공동 결정화 구조가 없는 수용체이므로 연구자들은 Glu247과 같은 리간드-CNOT7 단백질 상호 작용에 관련된 몇 가지 필수 아미노산 잔기를 보고한 이전 문헌의 가이드와 함께 MOE siteFinder 도구를 사용하여 연구에 도움을 주었습니다. Tyr260, Glu278(34,35)은 상대적으로 중요한 것으로 확인되었습니다.

3.3.2. 리간드 데이터 세트 큐레이션 MOE에서 구현된 '빌더 프로그램'은 연구에서 6개의 리간드를 모델링하는 데 사용되었습니다. 비타민 E, 콜히친, 프로디지오신, 리보플라빈, 텔미사르탄, 피오글리타존 등 생리학적 pH에서 가능한 모든 형태가 얻어졌습니다.

3.3.3. 도킹 시뮬레이션 6개 리간드의 획득된 형태 도킹은 MOE 프로그램의 배치 및 개선 알고리즘을 사용하여 수행되었습니다. 활성 부위에서 분자의 초기 도킹은 'Triangle Matcher' 배치 방법과 'London dG' 점수 매기기 기능을 사용했습니다. 도킹 포즈의 추가 배치 후 개선은 'GBVI/WSA dG' 채점 방법을 사용하여 달성되었습니다. 최소한의 에너지를 갖는 자세는 수용체의 결합 부위 점유뿐만 아니라 결합 상호작용의 시각화를 위해 사용되었습니다.

3.4. 통계분석 3.4.1. 수집된 데이터는 사회 과학 소프트웨어용 통계 패키지(SPSS, 버전 17, Chicago, IL, USA)를 사용하여 기록 및 분석되었습니다.

3.4.2. 정성적 데이터는 빈도(n)와 백분율(%)로 표시되었습니다. 3.4.3. Shapiro-Wilk 계산기를 사용하여 정량적 데이터 정규성 테스트를 수행했습니다. 정규 분포 변수는 평균 ± S.E.M으로 표시되었으며 두 그룹의 비교를 위해 두 샘플 독립 학생 t-테스트를 ​​사용하여 분석되었습니다. 정규 분포가 아닌 데이터는 중앙값(1~3사분위수 또는 25~75사분위수와 같은 사분위수 범위)으로 표시되었으며 Mann-Whitney(U) 테스트를 사용하여 분석되었습니다.

3.4.4. CNOT7 및 LAIR-1 혈청 수준을 낮은 발현 하위 그룹과 높은 발현 하위 그룹으로 분류하기 위한 최상의 컷오프 지점을 감지하기 위해 ROC 곡선을 수행했습니다.

3.4.5. CNOT7 혈청 수준과 임상 병리학 적 매개 변수 간의 연관성을 평가하기 위해 카이 제곱 테스트가 사용되었습니다. Pearson 상관 테스트는 매개 변수 간의 연관성을 평가하는 데 사용되었습니다. 매개변수 중 하나가 이분형 변수인 경우 매개변수 간의 상관관계를 확인하기 위해 점-이차 상관관계를 사용했습니다.

3.4.6. 유의수준은 P< 0.05, 신뢰수준(C.I) 또는 구간은 각각 95%와 5%로 설정하였다.