Důsledky exprese CCR4-NOT komplexní podjednotky 7 v odolnosti buněk přirozených zabíječů u metastatického karcinomu prsu (CCR4-NOT)

1. Úvod 1.1. Výzkumný problém. Rakovina prsu (BC) je primární příčinou úmrtí na rakovinu u žen (1,2). Hlavní příčinou této mortality je metastatické rozšíření do jiných orgánů (3). K metastázám dochází, když nádorové buňky získají invazivní vlastnosti (4) a schopnost uniknout z protinádorové imunity; vrozené a adaptivní imunitní odpovědi důležité pro kontrolu nádoru (5,6). Bylo hlášeno, že progresi BC doprovází závažné poškození přirozeného zabíječe (NK) buněk periferní krve a cytotoxických funkcí (7). Několik studií profilování genové exprese ukázalo, že lepší výsledek je spojen se silným cytotoxickým infiltrátem obsahujícím NK buňky (8,9). Tato data naznačují, že progrese BC je spojena s protinádorovou imunitní účinností NK buněk, T-buněk a B-buněk. Jak však progrese BC ovlivňuje fenotyp periferních NK buněk, není hojně zkoumáno.

Aktivita NK buněk je určena aktivačními a inhibičními receptory přítomnými na NK buňkách, které jsou spouštěny během rozpoznávání cílové buňky (zde nádorové buňky), indukující pozitivní nebo negativní buněčnou signální dráhu. Integrace těchto opačných signálů určuje váhu aktivace NK buněk (10). Nedávné studie ukázaly, že několik molekul, zejména inhibičních faktorů, které se často nacházejí v nádorovém mikroprostředí (TME), může výrazně narušit fenotyp a funkce NK buněk (11,12), což má za následek sníženou expresi aktivačních NK buněčných receptorů a zvýšenou expresi NK buněk. inhibiční receptory (jako LAIR-1, který byl dříve detekován v HCC klinických krevních vzorcích T-cytotoxických buněk (13). Ty mohou podporovat progresi BC a korelují se sníženou cytotoxickou funkcí imunitních buněk, se kterou se setkávají NK buňky a T-buňky nebo B-buňky (14).

1.2. Cíl a cíle. Za účelem prozkoumání role CNOT7 související s rezistencí imunitních buněk v metastázách BC se výzkumníci pokusili změřit sérové ​​hladiny CNOT7 v kohortě egyptských pacientek s BC ve vztahu ke klinickopatologickým parametrům. Byla měřena tkáňová exprese CNOT7 ve vzorcích tkáně BC kategorizovaných jako metastatický vs nemetastatický nádor spolu s přilehlým okrajem nenádorové tkáně. Dále byl kvantifikován inhibiční receptor na NK buňkách, jmenovitě; Sérové ​​hladiny LAIR-1, jejichž nadměrná exprese by byla spojena s agresivními rysy BC a nepříznivými klinickými výsledky (22), které se projevily jako TNM. Korelace CNOT7 s hladinami LAIR-1 v krvi bude hodnocena klinicky a bude potvrzena nebo zavedena prostřednictvím vyhledávání v bioinformatických databázích a analýzy in silico. Podle vyšetřovatelů hledají mechanismus metastáz BC, nejen zkoumání krevních hladin CNOT7 nebo LAIR1, a proto hledají další terapeutické možnosti prostřednictvím molekulárního dokování CNOT7 nebo blokováním jeho downstream drah nebo interakce mezi efektorovými geny a sítěmi, buď jako potenciálně slibné možnosti léčby. Kde budou tyto cesty a interakce získány z vyhledávání cest KEGG, dále řešeny prostřednictvím interakcí těžených z textu nebo hledáním v kurátorských databázích bioinformatiky in silico.

2.1. Účastníci studie 2.1.1. Etický souhlas a informovaný souhlas s účastí. Etický souhlas byl získán od Ain Shams University, Farmaceutické fakulty, revizní komise Research Ethical Committee (REC ID# 48, 20. října 2021).

2.1.2. Studie byla provedena podle pokynů Světové lékařské asociace (WMA) naplňujících etické zásady Helsinské deklarace pro lékařský výzkum zahrnující lidské subjekty, revidovanou verzi z července 2018, kde všichni zúčastnění jednotlivci podepsali eticky schválený informovaný souhlas (IC).

2.1.3. Skupiny pacientů BC. 90 pacientek s BC, dobrovolně zařazených do studie, s diagnózou buď primární naivní (nemetastatická) invazivní BC (46 pacientek) nebo metastatická BC (44 pacientek). Pacienti byli po podepsání IC náhodně zařazeni z oddělení klinické onkologie, lékařské fakulty, Mansoura University Hospitals, Mansoura University, Mansoura, Egypt.

2.1.4. Diagnostika BC byla provedena pomocí mamografie a magnetické rezonance (MRI). U všech účastníků studie (n = 90) byla shromážděna a zaznamenána úplná historie.

Vzorky krve a tkáňové parafinové bloky byly odebrány těm, kteří splnili kritéria pro zařazení a podepsali IC.

2.1.5. Klinické a patologické rysy pacientů. U všech účastníků BC byla zaznamenána úplná rodinná nemoc/nádorová anamnéza, stejně jako diabetický stav pacientek (ano vs ne), počet těhotenství (buď méně nebo více než 2), menopauzální stav (před vs. přijaté léčby (neoadjuvantní chemoterapie, adjuvantní chemoterapie, endokrinní terapie nebo mastektomie). Individuální aktuální stav rakoviny u pacientů a klinické hodnocení nádoru, provedené na lékařské fakultě, Mansoura University Hospital, Mansoura University, s použitím kategorizace tumor-node-metastasis (TNM) podle 8. vydání Amerického smíšeného výboru pro rakovinu ( AJCC) staging manual a Bloom-Richardson Scale for histological grading (24) shromážděné z datových souborů pacientů poté, co byla odebrána biopsie v době BC chirurgického průzkumu/vyšetření.

Výsledky imunohistochemie (IHC) pro index proliferace Ki-67 (buď nízký nebo vysoký), estrogenový receptor (ER), stav progesteronového receptoru (PR) a lidský epidermální růstový receptor 2 (HER2/neu) (každý buď pozitivní, nebo negativní), index tělesné hmotnosti (BMI) kg/m2 (normální, s nadváhou a obezitou 18,5-24,9, 25-29,9 a ≥30 kg/m2, v tomto pořadí) (25), stav lymfatických uzlin (LN) (žádné N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) a věk v letech ze spisů pacientů a tabulkové pro statistickou analýzu.

Molekulární podtyp BC (27), pokud je luminální (ER+ a/nebo PR+), nadměrná exprese HER-2 (ER-, PR-, HER-2+) nebo trojitě negativní BC (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) a histologické podtypy BC (28), zda invazivní duktální karcinom (IDC) či nikoli, byly všechny zaznamenány pro korelační analýzu.

3. Metody 3.1. Biochemická analýza 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 byla hodnocena pomocí ELISA sady Human CCR4 NOT transkripčního komplexu podjednotky 7 (CNOT7), Mybiosource, USA, podle pokynů výrobce. Ve stručnosti, standardy a vzorky séra jak nemetastatických BC, tak metastatických BC skupin byly inkubovány společně s CNOT7-HRP konjugátem v anti-CNOT7 protilátkou předem potažené ELISA destičce dodané výrobcem po dobu jedné hodiny při 37 °C. Po inkubační době byly jamky dekantovány a promyty pětkrát ručně pomocí předem zředěného promývacího pufru poskytnutého výrobcem. Jamky se inkubovaly se substrátem pro enzym HRP po dobu jedné hodiny při 37 °C. Nakonec byl přidán zastavovací roztok pro zastavení reakce. Vytvořená intenzita barvy byla měřena spektrofotometricky při 450 nm ve čtečce mikrodestiček. Byla vynesena standardní křivka vztahující intenzitu barvy (optická hustota (O.D.)) ke koncentraci standardů. Koncentrace CNOT7 v každém vzorku byla interpolována z této standardní křivky (doplňkový soubor).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 byl hodnocen pomocí Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, USA. Standardy a vzorky byly pipetovány do jamek destičky ELISA předem potažené LAIR-1 specifickou protilátkou dodanou výrobcem. Destička byla poté zakryta a inkubována při 37 °C po dobu 45 minut. následovalo 5-násobné ruční promývání za použití promývacího pufru, který byl předem naředěn. Na destičku byla přidána detekční protilátka konjugovaná s HRP a destička byla znovu inkubována při stejné teplotě po dobu 30 minut. Poté byla destička promyta, jak bylo vysvětleno dříve, a inkubována s roztoky chromogenu po dobu 15 minut. následuje poslední krok přidání stop roztoku. Intenzita barvy byla měřena spektrofotometricky při 450 nm ve čtečce mikrodestiček. Vynese se standardní křivka vztahující se k intenzitě barvy (OD) ke koncentraci standardů. Koncentrace LAIR-1 v každém vzorku byla interpolována z této standardní křivky (doplňkový soubor). Standardy byly připraveny ze zásobního roztoku a standardního ředidla poskytnutého výrobcem, čímž se vytvořila série dvojnásobných ředění 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Test sérového inzulínu byl proveden pomocí soupravy Hyperion Inc., Miami, FL, USA ELISA kit. Intenzita barvy testovaného vzorku je přímo nepřímo úměrná jeho koncentraci inzulínu. Normální hladina inzulinu pro dospělé je 0-25 mU/l.

3.1.2. Imunohistochemie 3.1.2.1. Protokol barvení CNOT7 IHC Použití parafínových řezů upevněných na kladně nabitá sklíčka pomocí techniky komplexu avidin-biotin-peroxidáza (ABC) (29). Řezy z každé skupiny byly ošetřeny CNOT7 (M01) (ABNOVA, kat. č. H00029883-M01, monoklonální protilátka, klon 2F6) v ředění 1:25, než byly vystaveny chemikáliím nezbytným pro metodu ABC (souprava Vectastain ABC-HRP, vektor laboratoře). Pro detekci komplexů antigen-protilátka byla exprese markeru označena peroxidázou a obarvena diaminobenzidinem (DAB, výrobce Sigma). Negativní kontroly byly zahrnuty s použitím neimunního séra místo primárních nebo sekundárních protilátek. Mikroskop Leica (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Švýcarsko) byl použit k hodnocení řezů obarvených IHC (Leica Microsystems, Švýcarsko).

3.1.2.2. Kvantitativní vyhodnocení výsledků CNOT7 IHC "% plochy" V každém sériovém řezu analyzovaných skupin pacientů bylo k vyšetření vybráno šest vysoce výkonných polí (x 400) s pozitivním hnědým imunobarvením. Procento plochy řezů obarvených CNOT7 bylo vypočteno pomocí počítačového systému analyzátoru obrazu Leica QWin 500 (UK). Tento analyzátor obrazu zahrnoval mikroskop Leica, barevnou videokameru, barevný monitor a pevný disk osobního počítače Leica IBM propojeného s mikroskopem a spravovaného softwarem Leica QWin 500.

Údaje o % plochy byly statisticky uvedeny jako průměr a standardní chyba průměru (průměr ± SEM) pro osm snímků ze čtyř nemetastatických vzorků a čtyř metastatických vzorků.

3.2. Bioinformatická analýza in silico 3.2.1. Rakovina prsu Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Aktualizováno 28. června 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) ke zkoumání korelace mezi CNOT7 a LAIR1.

3.2.2. Funkční modul LinkedOmics používaný k provádění analýzy biologického procesu genové ontologie (GO_BP) s analýzou obohacení genové sady (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Interakce a cesty mezi geny a geny z databází spravovaných in silico a dolování textu prostřednictvím prohlížeče genomu pro cílové geny pomocí University of California Santa Cruiz (UCSC) (32) Institut genomiky http://genome.ucsc.edu/index.html Byly získány interakce genů LAIR1 a CNOT7 s uvedením známého inhibičního léku (léků) z DrugBank.

3.2.4. Protein-Protein Interaction (PPI) z databáze Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) verze 11.5 https://string-db.org/, která předpovídá interakce na základě relevantních experimentálních dat, výsledků sekvenování a literatury z >1100 plně sekvenovaných organismů (33). Přístupné 20. ledna 2023 za účelem prozkoumání proteinů interagujících s LAIR-1.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Zkoumání vzorců genové exprese v normálních a nádorových tkáních (GENT2) s přežitím http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Molekulární dokování: 3.3.1. Příprava proteinových struktur LAIR-1 a CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Z proteinové databanky (PDB) https:// www.rcsb.org/search krystalovou strukturu lidského LAIR-1 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Po načtení struktur v molekulárním operačním prostředí (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Integrovaná platforma Computer-Aided Molecular Design Platform, byly připraveny s použitím výchozích parametrů v panelu „QuickPrep Panel“ včetně odstranění molekul vody, přidání atomů vodíku do proteinové struktury, úpravy protonačních stavů a ​​zajištění minimalizace energie proteinových struktur pomocí Amber10. :EHT silové pole.

Protože tyto krystalové struktury nebyly ko-krystalizovány s žádnými ligandy, MOE SiteFinder, program pro analýzu vazebných míst vybavený v MOE, byl použit k predikci možných vazebných míst. Tyto kapsy jsou seřazeny podle jejich sklonu k vazbě ligandu (PLB). CNOT7 je receptor bez dostupné ko-krystalizované struktury PDB, proto výzkumníci použili nástroj MOE siteFinder, aby nám pomohl v naší studii, přičemž průvodce z předchozích literatur uvádí několik esenciálních aminokyselinových zbytků zapojených do interakcí ligand-CNOT7 protein, jako je Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) byly identifikovány jako relativně významné.

3.3.2. Úprava datové sady ligandů K modelování šesti ligandů ve studii byl použit „program pro vytváření“ implementovaný v MOE; Vitamin E, kolchicin, prodigiosin, riboflavin, telmisartan a pioglitazon, kde byly získány všechny možné konformace při fyziologickém pH.

3.3.3. Simulace dokování Dokování získaných konformací šesti ligandů bylo provedeno pomocí umisťovacích a zpřesňujících algoritmů programu MOE. Počáteční dokování molekul v aktivních místech použilo metodu umístění 'Triangle Matcher' a skórovací funkci 'London dG'. Dalšího zpřesnění dokovacích pozic po umístění bylo dosaženo použitím skórovací metody 'GBVI/WSA dG'. Pro vizualizaci vazebných interakcí i obsazení vazebného místa receptorů byly použity pozice s minimální energií.

3.4. Statistická analýza 3.4.1. Shromážděná data byla zaznamenána a analyzována pomocí softwaru Statistical Package for Social Science (SPSS, verze 17, Chicago, IL, USA).

3.4.2. Kvalitativní údaje byly prezentovány jako četnosti (n) a procenta (%). 3.4.3. Test kvantitativní normality dat byl proveden pomocí Shapiro-Wilkova kalkulátoru. Normálně distribuované proměnné byly reprezentovány jako průměr ± SEM a analyzovány pomocí Studentova t-testu nezávislého na dvou vzorcích pro srovnání dvou skupin. Nenormálně rozložená data byla prezentována jako mediány (interkvartilní rozsahy jako první až třetí kvartil nebo 25.-75. kvartil) a analyzována pomocí Mann-Whitneyho (U) testu.

3.4.4. ROC křivka byla provedena pro detekci nejlepších hraničních bodů pro kategorizaci sérových hladin CNOT7 a LAIR-1 do podskupin s nízkou a vysokou expresí.

3.4.5. Chí-kvadrát test byl použit k vyhodnocení asociace mezi hladinami CNOT7 v séru a klinicko-patologickými parametry. K posouzení asociace mezi parametrickými proměnnými byl použit Pearsonův korelační test. K určení korelace mezi parametry, kdy jeden z nich byl dichotomickou proměnnou, byly použity bodové biserální korelace.

3.4.6. Hladina významnosti byla nastavena na P < 0,05 a hladina spolehlivosti (C.I) nebo interval na 95 % a 5 %, v daném pořadí.