Влияние экспрессии субъединицы 7 комплекса CCR4-NOT на устойчивость естественных клеток-киллеров при метастатическом раке молочной железы (CCR4-NOT)

1. Введение 1.1. Проблема исследования. Рак молочной железы (РМЖ) является основной причиной смертности от рака у женщин (1,2). Основной причиной этой смертности является метастатическое распространение на другие органы (3). Метастазирование возникает, когда опухолевые клетки приобретают инвазивные свойства (4) и способность ускользать от противоопухолевого иммунитета; врожденные и адаптивные иммунные реакции, важные для контроля опухоли (5,6). Сообщалось, что серьезное нарушение созревания естественных киллеров (NK) клеток периферической крови и цитотоксических функций сопровождает прогрессирование РМЖ (7). Несколько исследований по профилированию экспрессии генов показали, что лучший результат связан с сильным цитотоксическим инфильтратом, содержащим NK-клетки (8,9). Эти данные позволяют предположить, что прогрессирование РМЖ связано с противоопухолевой иммунной эффективностью NK-клеток, Т-клеток и В-клеток. Однако то, как прогрессирование РМЖ влияет на фенотип периферических NK-клеток, недостаточно изучено.

Активность NK-клеток определяется активацией и ингибированием рецепторов, присутствующих на NK-клетках, которые запускаются во время распознавания клеток-мишеней (в данном случае опухолевых клеток), индуцируя соответственно положительный или отрицательный сигнальный путь клеток. Интеграция этих противоположных сигналов определяет вес активации NK-клеток (10). Недавние исследования показали, что некоторые молекулы, особенно ингибирующие факторы, часто встречающиеся в микроокружении опухоли (ТМЕ), могут резко нарушать фенотип и функции NK-клеток (11,12), что приводит к снижению экспрессии активирующих рецепторов NK-клеток и увеличению экспрессии ингибирующие рецепторы (например, LAIR-1, который был обнаружен ранее в клинических образцах крови ГЦК, Т-цитотоксические клетки (13). Они могут способствовать прогрессированию РМЖ и коррелируют со снижением цитотоксической функции иммунных клеток, с которым сталкиваются NK-клетки и Т-клетки или В-клетки (14).

1.2. Цель и задачи. Чтобы изучить роль CNOT7, связанную с резистентностью иммунных клеток при метастазах РМЖ, исследователи попытались измерить уровни CNOT7 в сыворотке крови у египетских женщин, больных РМЖ, в зависимости от клинико-патологических параметров. Была измерена экспрессия ткани CNOT7 в образцах тканей РМЖ, классифицированных как метастатическая и неметастатическая опухоль, а также с прилегающими неопухолевыми краями ткани. Кроме того, количественно определили ингибирующий рецептор на NK-клетках, а именно; Уровни LAIR-1 в сыворотке, сверхэкспрессия которых будет связана с агрессивными проявлениями РМЖ и неблагоприятными клиническими исходами (22), проявляющимися как TNM. Корреляция CNOT7 с уровнями LAIR-1 в крови должна быть оценена клинически и подтверждена или развернута с помощью поиска в базах данных биоинформатики и анализа in silico. По мнению исследователей, они ищут механизм метастазирования РМЖ, а не просто изучают уровни CNOT7 или LAIR1 в крови, поэтому находят больше терапевтических вариантов, посредством стыковки молекул CNOT7 или путем блокирования его нижестоящих путей или взаимодействия эффекторных ген-генных сетей, что является потенциально многообещающим. варианты лечения. При этом эти пути и взаимодействия будут извлекаться из поиска путей KEGG, а затем обрабатываться посредством текстовых взаимодействий или поиска в курируемых in silico биоинформатических базах данных.

2.1. Участники исследования 2.1.1. Этическое одобрение и информированное согласие на участие. Этическое одобрение было получено от исследовательского этического комитета фармацевтического факультета Университета Айн-Шамс (REC ID № 48, 20 октября 2021 г.).

2.1.2. Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами Всемирной медицинской ассоциации (WMA), выполняющими Хельсинкскую декларацию этических принципов медицинских исследований с участием людей, пересмотренную версию от июля 2018 года, в которой все участвующие лица подписали этически одобренное информированное согласие (IC).

2.1.3. Группы пациентов БК. У 90 женщин-пациенток РМЖ, добровольно участвовавших в исследовании, был диагностирован либо первичный наивный (неметастатический) инвазивный РМЖ (46 пациентов), либо метастатический РМЖ (44 пациента). Пациенты были набраны случайным образом из отделения клинической онкологии медицинского факультета университетских больниц Мансуры, Университета Мансура, Мансура, Египет, после подписания IC.

2.1.4. Диагностика РМЖ проводилась с помощью маммографии и магнитно-резонансной томографии (МРТ). Полный анамнез был собран и записан для всех участников исследования (n = 90).

Образцы крови и тканевые парафиновые блоки были собраны у тех, кто соответствовал критериям включения и подписал ИК.

2.1.5. Клинико-патологические особенности пациентов. Для всех участников BC была записана полная семейная история болезни/рака, а также диабетический статус пациенток (да или нет), количество беременностей (меньше или более 2), статус менопаузы (до или после) и полученное лечение (неоадъювантная химиотерапия, адъювантная химиотерапия, эндокринная терапия или мастэктомия). Индивидуальный текущий раковый статус пациентов и клиническая оценка опухоли, проведенная на медицинском факультете университетской больницы Мансура Университета Мансура с использованием классификации опухолевых узлов-метастазирования (TNM) в соответствии с 8-м изданием Американского объединенного комитета по раку ( AJCC) руководство по стадированию и шкалу Блума-Ричардсона для гистологической оценки (24), собранную из файлов данных пациентов после взятия биопсии во время хирургического исследования/обследования РМЖ.

Результаты иммуногистохимии (ИГХ) для индекса пролиферации Ki-67 (низкий или высокий), статуса рецептора эстрогена (ER), рецептора прогестерона (PR) и человеческого эпидермального рецептора роста 2 (HER2/neu) (каждый либо положительный, либо положительный или отрицательный), индекс массы тела (ИМТ) кг/м2 (нормальный, избыточный вес и ожирение 18,5-24,9, 25-29,9 и ≥30 кг/м2 соответственно) (25), состояние лимфатических узлов (ЛУ) (нет N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) и возраст в годах. из историй болезни пациентов и занесены в таблицы для статистического анализа.

Молекулярный подтип РМЖ (27), если люминальноподобный (ER+ и/или PR+), сверхэкспрессия HER-2 (ER-, PR-, HER-2+) или тройной негативный РМЖ (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) и гистологические подтипы РМЖ (28), независимо от того, является ли инвазивная протоковая карцинома (IDC) или нет, все были записаны для корреляционного анализа.

3. Методы 3.1. Биохимический анализ 3.1.1. ИФА 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 оценивали с использованием набора ELISA субъединицы 7 транскрипционного комплекса CCR4 NOT человека (CNOT7), Mybiosource, США, в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, стандарты и образцы сыворотки как групп неметастатического РМЖ, так и групп метастатического РМЖ инкубировали вместе с конъюгатом CNOT7-HRP в планшете для ELISA, предварительно покрытом антителом против CNOT7, поставляемом производителем, в течение часа при 37°C. После периода инкубации лунки декантировали и пять раз промывали вручную с использованием предварительно разбавленного промывочного буфера, предоставленного производителем. Лунки инкубируют с субстратом для фермента HRP в течение часа при 37°С. Наконец, для остановки реакции добавляли стоп-раствор. Интенсивность полученного цвета измеряли спектрофотометрически при 450 нм в микропланшетном ридере. Строили стандартную кривую, связывающую интенсивность цвета (оптическую плотность (ОП)) с концентрацией стандартов. Концентрация CNOT7 в каждом образце была интерполирована по этой стандартной кривой (дополнительный файл).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 оценивали с использованием набора Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, США. Стандарты и образцы вносили пипеткой в ​​лунки планшета для ELISA, предварительно покрытого специфичным к LAIR-1 антителом, поставляемым производителем. Затем планшет накрывали и инкубировали при 37°С в течение 45 мин. с последующей 5-кратной ручной промывкой с использованием предварительно разбавленного промывочного буфера. В планшет добавляли детектирующее антитело, конъюгированное с HRP, и снова инкубировали при той же температуре в течение 30 мин. После этого планшет промывали, как объяснялось ранее, и инкубировали с растворами хромогена в течение 15 минут. за которым следует последний этап добавления стоп-раствора. Интенсивность цвета измеряли спектрофотометрически при 450 нм в микропланшетном ридере. Строят стандартную кривую, связывающую интенсивность цвета (ОП) с концентрацией стандартов. Концентрацию LAIR-1 в каждом образце интерполировали по этой стандартной кривой (дополнительный файл). Стандарты готовили из исходного раствора и стандартного разбавителя, предоставленного производителем, для серии 2-кратных разведений 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Анализ сывороточного инсулина проводили с использованием набора ELISA Hyperion Inc., Майами, Флорида, США. Интенсивность цвета тестируемого образца прямо обратно пропорциональна концентрации инсулина. Нормальный уровень инсулина для взрослых составляет 0–25 мЕд/л.

3.1.2. Иммуногистохимия 3.1.2.1. Протокол окрашивания CNOT7 IHC. Использование парафиновых срезов, закрепленных на положительно заряженных предметных стеклах с использованием метода авидин-биотин-пероксидазного комплекса (ABC) (29). Срезы из каждой группы обрабатывали CNOT7 (M01) (ABNOVA, Cat# H00029883-M01, моноклональные антитела, клон 2F6) в разведении 1:25 перед воздействием химикатов, необходимых для метода ABC (набор Vectastain ABC-HRP, Vector). лаборатории). Для обнаружения комплексов антиген-антитело экспрессию маркера метили пероксидазой и окрашивали диаминобензидином (DAB, производства Sigma). Отрицательные контроли были включены с использованием неиммунной сыворотки вместо первичных или вторичных антител. Для оценки окрашенных ИГХ срезов (Leica Microsystems, Швейцария) использовали микроскоп Leica (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Швейцария).

3.1.2.2. Количественная оценка результатов ИГХ CNOT7 «Площадь %» В каждом серийном срезе анализируемых групп пациентов для исследования были выбраны шесть полей высокого увеличения (х 400) с положительным коричневым иммуноокрашиванием. % площади срезов, окрашенных CNOT7, рассчитывали с использованием компьютерной системы анализатора изображений Leica QWin 500 (Великобритания). Этот анализатор изображений включал в себя микроскоп Leica, цветную видеокамеру, цветной монитор и жесткий диск персонального компьютера Leica IBM, подключенного к микроскопу и управляемого программным обеспечением Leica QWin 500.

Данные о % площади были статистически представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (среднее значение ± SEM) для восьми изображений из четырех неметастатических образцов и четырех метастатических образцов.

3.2. Биоинформатический анализ in silico 3.2.1. Miner Gene Expression Miner рака молочной железы v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Обновлено 28 июня 2023 г.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30), чтобы изучить корреляцию между CNOT7 и LAIR1.

3.2.2. Функциональный модуль LinkedOmics, используемый для анализа биологического процесса Gene Ontology (GO_BP) с анализом обогащения набора генов (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Ген-генные взаимодействия и пути из баз данных, курируемых in silico, и анализ текста с помощью браузера генома для целевых генов с использованием Калифорнийского университета в Санта-Круисе (UCSC) (32) Институт геномики http://genome.ucsc.edu/index.html Были выявлены взаимодействия генов LAIR1 и CNOT7 с упоминанием известных препаратов-ингибиторов из DrugBank.

3.2.4. Белково-белковое взаимодействие (PPI) из базы данных инструмента поиска для поиска взаимодействующих генов/белков (STRING) версии 11.5 https://string-db.org/, которая прогнозирует взаимодействия на основе соответствующих экспериментальных данных, результатов секвенирования и литературы из >1100 полностью секвенированных организмов (33). Доступ осуществлен 20 января 2023 г. для изучения белков, взаимодействующих с LAIR-1.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Изучение закономерностей экспрессии генов в нормальных и опухолевых тканях (GENT2) с выживанием http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Молекулярный докинг: 3.3.1. Получение белковых структур LAIR-1 и CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Из банка данных белков (PDB) https:// www.rcsb.org/найдите кристаллическую структуру LAIR-1 человека (ID PDB: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 После загрузки структур в молекулярную операционную среду (МОЭ) https://www.chemcomp.com/Products.htm. Интегрированная платформа компьютерного молекулярного проектирования. Они были подготовлены с использованием параметров по умолчанию на «панели QuickPrep», включая удаление молекул воды, добавление атомов водорода в структуру белка, настройку состояний протонирования и обеспечение минимизации энергии белковых структур с помощью Amber10. :ЭХТ силовое поле.

Поскольку эти кристаллические структуры не были сокристаллизованы с какими-либо лигандами, для прогнозирования возможных сайтов связывания использовалась MOE SiteFinder, программа для анализа сайтов связывания, встроенная в MOE. Эти карманы ранжируются на основе их склонности к связыванию лигандов (PLB). CNOT7 является рецептором без доступной сокристаллизованной структуры PDB, поэтому исследователи использовали инструмент MOE siteFinder, чтобы помочь в нашем исследовании, с руководством по предыдущим литературным источникам, сообщающим о нескольких незаменимых аминокислотных остатках, участвующих во взаимодействиях лиганд-белок CNOT7, таких как Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) были идентифицированы как относительно значимые.

3.3.2. Курирование набора данных по лигандам «Программа-конструктор», реализованная в MOE, использовалась для моделирования шести лигандов в исследовании; Витамин Е, колхицин, продигиозин, рибофлавин, телмисартан и пиоглитазон, где были получены все возможные конформации при физиологическом pH.

3.3.3. Моделирование стыковки. Стыковку полученных конформаций шести лигандов осуществляли с использованием алгоритмов размещения и уточнения программы MOE. Для первоначальной стыковки молекул в активных центрах использовался метод размещения «Triangle Matcher» и оценочная функция «London dG». Дальнейшее уточнение поз стыковки после размещения было достигнуто с использованием метода оценки GBVI/WSA dG. Позы с минимальной энергией использовались для визуализации связывающих взаимодействий, а также занятости места связывания рецепторов.

3.4. Статистический анализ 3.4.1. Собранные данные записывались и анализировались с использованием программного обеспечения «Статистический пакет для социальных наук» (SPSS, версия 17, Чикаго, Иллинойс, США).

3.4.2. Качественные данные были представлены в виде частот (n) и процентов (%). 3.4.3. Тест на нормальность количественных данных проводился с использованием калькулятора Шапиро-Уилка. Нормально распределенные переменные были представлены как среднее значение ± SEM и проанализированы с использованием двух выборок независимого t-критерия Стьюдента для сравнения двух групп. Ненормально распределенные данные были представлены в виде медиан (межквартильные диапазоны в виде первого-третьего квартилей или 25-75-го квартилей) и проанализированы с использованием критерия Манна-Уитни (U).

3.4.4. Кривая ROC была построена для определения лучших пороговых точек для разделения уровней CNOT7 и LAIR-1 в сыворотке на подгруппы с низкой и высокой экспрессией.

3.4.5. Критерий Хи-квадрат использовался для оценки связи между уровнями CNOT7 в сыворотке и клинико-патологическими параметрами. Корреляционный тест Пирсона использовался для оценки связи между параметрическими переменными. Точечно-бисерийные корреляции использовались для определения корреляции между параметрами, когда один из них был дихотомической переменной.

3.4.6. Уровень значимости был установлен на уровне P <0,05, а уровень достоверности (ДИ) или интервал - на уровне 95% и 5% соответственно.