Implikasjon av CCR4-NOT kompleks underenhet 7 uttrykk i naturlig mordercellemotstand i metastatisk brystkreft (CCR4-NOT)

1. Innledning 1.1. Forskningsproblem. Brystkreft (BC) er den primære årsaken til kreftdødsfall hos kvinner (1,2). Hovedårsaken til denne dødeligheten er metastatisk spredning til andre organer (3). Metastase oppstår når tumorceller får invasive egenskaper (4) og evnen til å rømme fra antitumorimmunitet; medfødte og adaptive immunresponser viktig for svulstkontroll (5,6). Stor svekkelse av perifert blod naturlig morder (NK) cellemodning og cytotoksiske funksjoner ble rapportert å følge BC-progresjon (7). Flere genekspresjonsprofileringsstudier har vist at et bedre resultat er assosiert med et sterkt cytotoksisk infiltrat som inneholder NK-celler (8,9). Disse dataene tyder på at BC-progresjon er knyttet til antitumorimmuneffektiviteten til NK-celler, T-celler og B-celler. Hvordan BC-progresjon påvirker perifere NK-cellers fenotype er imidlertid ikke rikelig undersøkt.

Aktiviteten til NK-celler bestemmes av aktiverende og hemmende reseptorer som er tilstede på NK-celler som utløses under gjenkjenning av målceller (heri tumorcelle), som induserer henholdsvis en positiv eller en negativ cellesignalvei. Integreringen av disse motsatte signalene bestemmer NK-celleaktiveringsvekten (10). Nyere studier har vist at flere molekyler, spesielt hemmende faktorer, ofte funnet i tumormikromiljøet (TME) kan kraftig svekke NK-cellers fenotype og funksjoner (11,12), noe som resulterer i redusert uttrykk for aktiverende NK-cellereseptorer og økt ekspresjon av de hemmende reseptorene (som LAIR-1 som tidligere ble påvist i HCC kliniske blodprøver T-cytotoksiske celler (13). Disse kan fremme BC-progresjon og vil korrelere med den reduserte cytotoksiske immuncellefunksjonen som NK-celler og T-celler eller B-celler møter (14).

1.2. Mål og mål. For å utforske CNOT7-rollen relatert til immuncellers motstand i BC-metastaser, forsøkte etterforskerne å måle serumnivåene av CNOT7 i kohorten til egyptiske kvinnelige BC-pasienter i forhold til de klinikopatologiske parameterne. CNOT7-vevsuttrykk i BC-vevsprøver kategorisert som metastatisk vs ikke-metastatisk tumor sammen med tilstøtende ikke-tumorvevsmargin ble målt. Videre kvantifiserte den hemmende reseptoren på NK-celler, nemlig; LAIR-1 serumnivåer, hvis overekspresjon vil være knyttet til de aggressive BC-trekkene og uønskede kliniske utfall(er) (22) manifestert som TNM. Korrelasjonen av CNOT7 med LAIR-1-blodnivåer som skal vurderes klinisk og som skal bekreftes eller rulles ut via søk i bioinformatikkdatabaser og i silico-analyse. Per etterforskerne leter etter BC-metastasemekanisme, ikke bare å utforske CNOT7- eller LAIR1-blodnivåer, og derfor finne flere terapeutiske alternativer, via CNOT7 molekylær dokking eller gjennom å blokkere dens nedstrømsveier eller effektor-gen-gen-nettverk interaksjon, enten som potensielt lovende behandlingsalternativer. Hvor vil disse banene og interaksjonene bli hentet fra KEGG-stisøk, videre adressert gjennom tekstminerte interaksjoner eller søk i kuraterte i silico bioinformatikk DB-er.

2.1. Studiedeltakere 2.1.1. Etisk godkjenning og informert samtykke til å delta. Etisk godkjenning ble innhentet fra Ain Shams University, Det farmasøytiske fakultetets vurderingsstyre Research Ethical Committee (REC ID# 48, 20. oktober 2021).

2.1.2. Studien ble utført i henhold til retningslinjer av World Medical Association (WMA) som oppfyller Helsinki-erklæringen etiske prinsipper for medisinsk forskning som involverer mennesker, den reviderte juli 2018-versjonen, der alle deltakende individer signerte det etisk godkjente informerte samtykket (IC).

2.1.3. BC pasientgrupper. 90 kvinnelige BC-pasienter, frivillig i studien, diagnostisert med enten primær naiv (ikke-metastatisk) invasiv BC (46 pasienter) eller metastatisk BC (44 pasienter). Pasienter ble registrert tilfeldig fra den kliniske onkologiske avdelingen, Det medisinske fakultet, Mansoura universitetssykehus, Mansoura University, Mansoura, Egypt, etter signering av IC.

2.1.4. BC-diagnose ble utført med mammografi og magnetisk resonanstomografi (MRI). Full historie ble samlet inn og registrert for alle studiedeltakerne (n = 90).

Blodprøver og vevsparaffinblokkene ble samlet inn for de som oppfylte inklusjonskriteriene og signerte IC.

2.1.5. Pasientenes kliniske og patologiske trekk. For alle BC-deltakere ble det registrert full familiesykdom/krefthistorie, så vel som pasientenes diabetiske status (ja mot nei), antall graviditeter (enten færre eller flere enn 2), menopausal status (før-vs post-) og behandling(er) mottatt (neoadjuvant kjemoterapi, adjuvant kjemoterapi, endokrin terapi eller mastektomi). Pasienters individuelle nåværende kreftstatus og den kliniske tumorvurderingen, utført ved Det medisinske fakultet, Mansoura University Hospital, Mansoura University, ved bruk av tumor-node-metastasis (TNM)-kategoriseringen i henhold til den åttende utgaven av American Joint Committee on Cancer ( AJCC) iscenesettelsesmanual og Bloom-Richardson-skalaen for histologisk gradering (24) samlet inn fra pasientenes datafiler, etter at en biopsi ble tatt på tidspunktet for BC kirurgisk utforskning/undersøkelse.

Immunhistokjemi (IHC) resultater for spredningsindeksen Ki-67 (er enten lav eller høy), østrogenreseptor (ER), progesteronreseptor (PR) status og human epidermal vekstreseptor 2 (HER2/neu) (hver enten positiv eller negativ), kroppsmasseindeks (BMI) kg/m2 (normal, overvektig og fedme 18,5-24,9, hhv fra pasientenes filer og tabulert for statistisk analyse.

Molekylær BC-subtype (27) hvis luminal lignende (ER+ og/eller PR+), HER-2-overuttrykk (ER-, PR-, HER-2+), eller trippel-negativ BC (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) og histologiske BC-subtyper (28) om invasivt duktalt karsinom (IDC) eller ikke, ble alle registrert for korrelasjonsanalyse.

3. Metoder 3.1. Biokjemisk analyse 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 ble vurdert ved bruk av Human CCR4 NOT transkripsjonskompleks underenhet 7 (CNOT7) ELISA Kit, Mybiosource, USA, etter produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble standardene og serumprøvene fra både ikke-metastatiske BC- og metastatiske BC-grupper inkubert sammen med CNOT7-HRP-konjugat i en anti-CNOT7-antistoffbelagt ELISA-plate levert av produsenten i en time ved 37°C. Etter inkubasjonsperioden ble brønnene dekantert og vasket fem ganger manuelt ved å bruke en forhåndsfortynnet vaskebuffer levert av produsenten. Brønner inkubert med et substrat for HRP-enzym i en time ved 37°C. Til slutt ble en stoppløsning tilsatt for å stoppe reaksjonen. Fargeintensiteten som ble produsert ble målt spektrofotometrisk ved 450 nm i en mikroplateleser. En standardkurve ble plottet som relaterer fargeintensiteten (Optical Density (O.D.)) til konsentrasjonen av standarder. CNOT7-konsentrasjonen i hver prøve ble interpolert fra denne standardkurven (tilleggsfil).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 ble vurdert ved bruk av Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, USA. Standarder og prøver ble pipettert inn i brønnene på en ELISA-plate pre-belagt med et LAIR-1 spesifikt antistoff levert av produsenten. Platen ble deretter dekket og inkubert ved 37°C i 45 minutter. etterfulgt av et 5 ganger manuelt vasketrinn ved bruk av vaskebuffer som tidligere ble fortynnet. Et HRP-konjugert deteksjonsantistoff ble tilsatt til platen og det ble inkubert igjen ved samme temperatur i 30 minutter. Etterpå ble platen vasket som forklart tidligere og inkubert med kromogenløsninger i 15 min. etterfulgt av et siste trinn med tilsetning av stoppløsning. Fargeintensiteten ble målt spektrofotometrisk ved 450 nm i en mikroplateleser. En standardkurve er plottet som relaterer intensiteten til fargen (O.D.) til konsentrasjonen av standarder. LAIR-1-konsentrasjonen i hver prøve ble interpolert fra denne standardkurven (tilleggsfil). Standarder ble fremstilt fra en stamløsning og et standard fortynningsmiddel levert av produsenten som produserte en 2-gangers fortynningsserie 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Seruminsulinanalyse ble utført ved bruk av Hyperion Inc., Miami, FL, USA ELISA-sett. Testprøvens fargeintensitet er direkte omvendt relatert til insulinkonsentrasjonen. Normalt insulinnivå for voksne er 0-25 mU/L.

3.1.2. Immunhistokjemi 3.1.2.1. CNOT7 IHC-fargeprotokoll Bruk av parafinseksjoner montert på positivt ladede objektglass ved bruk av avidin-biotin-peroksidasekompleks (ABC)-teknikk (29). Seksjoner fra hver gruppe ble behandlet med CNOT7 (M01) (ABNOVA, Cat # H00029883-M01, Monoclonal antibody, Clone 2F6) ved 1:25 fortynning før de ble eksponert for kjemikaliene som er nødvendige for ABC-metoden (Vectastain ABC-HRP kit, Vector laboratorier). For å oppdage antigen-antistoffkomplekser ble markøruttrykk merket med peroksidase og farget med diaminobenzidin (DAB, produsert av Sigma). Negative kontroller ble inkludert ved bruk av ikke-immunserum i stedet for de primære eller sekundære antistoffene. Leica-mikroskop (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Sveits) ble brukt til å evaluere IHC-fargede seksjoner (Leica Microsystems, Sveits).

3.1.2.2. Kvantitativ evaluering av CNOT7 IHC-resultater "Area %" I hver seriedel av de analyserte pasientgruppene ble seks høyeffektfelt (x 400) med positiv brun immunfarging valgt for undersøkelse. Areal% av CNOT7-fargede seksjoner ble beregnet ved bruk av Leica QWin 500 bildeanalysatordatamaskinsystem (UK). Denne bildeanalysatoren innebar et Leica-mikroskop, et farget videokamera, en farget skjerm og en harddisk fra en Leica IBM-PC koblet til mikroskopet og administrert av Leica QWin 500-programvaren.

Areal %-data ble statistisk rapportert i form av gjennomsnitt og standardfeil for gjennomsnitt (gjennomsnitt ± S.E.M) for åtte bilder fra fire ikke-metastatiske prøver og fire metastatiske prøver.

3.2. In silico Bioinformatikkanalyse 3.2.1. Brystkreft Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Oppdatert 28. juni 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) for å utforske sammenhengen mellom CNOT7 og LAIR1.

3.2.2. Funksjonsmodul til LinkedOmics brukes til å utføre analyse av Gene Ontology biologiske prosess (GO_BP) med gensett-anrikningsanalyse (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Gen-gen-interaksjoner og -veier fra in silico-kuraterte DB-er og tekstutvinning Via Genome Browser for målgener ved bruk av University of California Santa Cruiz (UCSC) (32) Genomics institute http://genome.ucsc.edu/index.html LAIR1- og CNOT7-geninteraksjoner ble hentet, med omtale av kjente hemmermedisin(er) fra DrugBank.

3.2.4. Protein-Protein Interaction (PPI) fra Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) database versjon 11.5 https://string-db.org/ som forutsier interaksjoner basert på relevante eksperimentelle data, sekvenseringsresultater og litteratur fra >1100 fullstendig sekvensert organisme (33). Tilgang 20. januar 2023 for å utforske LAIR-1-interagerende proteiner.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Utforsker genuttrykksmønstre på tvers av normalt og svulstvev (GENT2) med overlevelse http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Molekylær dokking: 3.3.1. Utarbeidelse av proteinstrukturene til LAIR-1 og CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Fra proteindatabanken (PDB) https:// www.rcsb.org/search krystallstrukturen til Human LAIR-1 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Etter lasting av strukturene i molekylært driftsmiljø (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Integrert Computer-Aided Molecular Design Platform, de ble forberedt ved å bruke standardparametrene i 'QuickPrep Panel' inkludert fjerning av vannmolekyler, tilsetning av hydrogenatomer til proteinstrukturen, justering av protonasjonstilstander og sikring av energiminimering av proteinstrukturene med Amber10 :EHT kraftfelt.

Siden disse krystallstrukturene ikke ble ko-krystallisert med noen ligander, ble MOE SiteFinder, et program for bindingsstedanalyse utstyrt i MOE brukt til å forutsi mulige bindingsseter. Disse lommene er rangert basert på deres tilbøyelighet til ligandbinding (PLB). CNOT7 er en reseptor uten tilgjengelig PDB-samkrystallisert struktur, derfor brukte etterforskerne MOE siteFinder-verktøyet for å hjelpe i vår studie, med guiden fra tidligere litteratur som rapporterte flere essensielle aminosyrerester involvert i ligand-CNOT7 proteininteraksjoner som Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) har blitt identifisert som relativt signifikante.

3.3.2. Ligander-datasettkurering 'Builder-programmet' implementert i MOE ble brukt til å modellere seks ligander i studien; Vitamin E, Colchicin, Prodigiosin, Riboflavin, Telmisartan og Pioglitazon, hvor alle mulige konformasjoner ved den fysiologiske pH ble oppnådd.

3.3.3. Dokkingsimuleringer Dokking av de oppnådde konformasjonene til de seks liganden ble utført ved bruk av plasserings- og foredlingsalgoritmer fra MOE-programmet. Innledende dokking av molekylene i de aktive stedene brukte 'Triangle Matcher'-plasseringsmetoden og 'London dG'-scoringsfunksjonen. Ytterligere forfining etter plassering av forankringsposisjoner ble oppnådd ved å bruke 'GBVI/WSA dG'-scoringsmetoden. Posene med minimal energi ble brukt for visualisering av bindingsinteraksjonene samt okkupasjon av bindingsstedet til reseptorene.

3.4. Statistisk analyse 3.4.1. Data som ble samlet inn ble registrert og analysert ved hjelp av programvaren Statistical Package for Social Science (SPSS, versjon 17, Chicago, IL, USA).

3.4.2. Kvalitative data ble presentert som frekvenser (n) og prosenter (%). 3.4.3. Test for kvantitativ datanormalitet ble utført ved bruk av Shapiro-Wilk-kalkulatoren. Normalfordelte variabler ble representert som gjennomsnitt ± S.E.M og analysert ved bruk av to prøver uavhengige Studenters t-test for sammenligning av to grupper. Ikke normalfordelte data ble presentert som medianer (interkvartilområder som første til tredje kvartil eller 25.-75. kvartil) og analysert ved hjelp av Mann-Whitney (U)-testen.

3.4.4. ROC-kurve ble utført for å oppdage de beste grensepunktene for å kategorisere CNOT7- og LAIR-1-serumnivåer i lav- og høyekspresjonsundergrupper.

3.4.5. Chi-square-testen ble brukt til å evaluere sammenhengen mellom CNOT7 serumnivåer og klinisk patologiske parametere. Pearson korrelasjonstest ble brukt for å vurdere sammenhengen mellom parametriske variabler. Punkt-biserielle korrelasjoner ble brukt for å bestemme korrelasjonen mellom parametere når en av dem var en dikotom variabel.

3.4.6. Signifikansnivået ble satt til P<0,05 og konfidensnivå (C.I) eller intervall til henholdsvis 95 % og 5 %.