Implicatie van CCR4-NOT complexe subeenheid 7-expressie in Natural Killer Cell-resistentie bij gemetastaseerde borstkanker (CCR4-NOT)

1. Inleiding 1.1. Onderzoeks probleem. Borstkanker (BC) is de voornaamste oorzaak van sterfgevallen door kanker bij vrouwen (1,2). De belangrijkste oorzaak van deze sterfte is de uitgezaaide verspreiding naar andere organen (3). Metastase treedt op wanneer tumorcellen invasieve kenmerken verwerven (4) en het vermogen krijgen om te ontsnappen aan antitumorimmuniteit; aangeboren en adaptieve immuunreacties die belangrijk zijn voor tumorcontrole (5,6). Er werd gemeld dat een ernstige verslechtering van de rijping van de natuurlijke killercellen (NK) in het perifere bloed en de cytotoxische functies gepaard gingen met BC-progressie (7). Verschillende onderzoeken naar genexpressieprofilering hebben aangetoond dat een beter resultaat geassocieerd is met een sterk cytotoxisch infiltraat dat NK-cellen bevat (8,9). Deze gegevens suggereren dat BC-progressie verband houdt met de antitumorale immuunefficiëntie van NK-cellen, T-cellen en B-cellen. Hoe BC-progressie het fenotype van perifere NK-cellen beïnvloedt, wordt echter niet overvloedig onderzocht.

De activiteit van NK-cellen wordt bepaald door activerende en remmende receptoren die aanwezig zijn op NK-cellen en die worden geactiveerd tijdens herkenning van doelcellen (hier: tumorcellen), waardoor respectievelijk een positieve of een negatieve celsignaleringsroute wordt geïnduceerd. De integratie van deze tegengestelde signalen bepaalt het activeringsgewicht van de NK-cellen (10). Recente onderzoeken hebben aangetoond dat verschillende moleculen, met name remmende factoren, die vaak in de micro-omgeving van de tumor (TME) worden aangetroffen, het fenotype en de functies van NK-cellen sterk kunnen aantasten (11,12), wat resulteert in een verminderde expressie van activerende NK-celreceptoren en een verhoogde expressie van de remmende receptoren (zoals LAIR-1 die eerder werd gedetecteerd in HCC klinische bloedmonsters van T-cytotoxische cellen (13). Deze kunnen de BC-progressie bevorderen en zouden correleren met de verminderde cytotoxische functie van immuuncellen die wordt aangetroffen door NK-cellen en T-cellen of B-cellen (14).

1.2. Doel en doelstellingen. Om de rol van CNOT7 gerelateerd aan de resistentie van immuuncellen bij BC-metastasen te onderzoeken, probeerden de onderzoekers de serumniveaus van CNOT7 in het cohort van Egyptische vrouwelijke BC-patiënten te meten in relatie tot de klinisch-pathologische parameters. CNOT7-weefselexpressie in BC-weefselmonsters gecategoriseerd als metastatische versus niet-metastatische tumor naast de aangrenzende niet-tumorweefselmarge werd gemeten. Verder werd de remmende receptor op NK-cellen gekwantificeerd, namelijk; LAIR-1-serumniveaus, waarvan de overexpressie verband zou houden met de agressieve BC-kenmerken en ongunstige klinische uitkomst(en) (22), die zich manifesteren als TNM. De correlatie van CNOT7 met LAIR-1-bloedwaarden moet klinisch worden beoordeeld en moet worden bevestigd of uitgerold via het zoeken in bio-informaticadatabases en in silico-analyse. Volgens de onderzoekers zijn ze op zoek naar het BC-metastasemechanisme, en onderzoeken ze niet alleen de CNOT7- of LAIR1-bloedniveaus, en vinden ze daarom meer therapeutische opties, via moleculaire koppeling van CNOT7 of door het blokkeren van de stroomafwaartse routes of de interactie van effectorgen-gennetwerken, ofwel als potentieel veelbelovend. behandelingsopties. Waar deze routes en interacties zullen worden opgehaald uit het zoeken naar KEGG-paden, verder worden aangepakt door middel van tekstgemineerde interacties of zoeken naar samengestelde in silico bio-informatica-DB's.

2.1. Studiedeelnemers 2.1.1. Ethische goedkeuring en geïnformeerde toestemming om deel te nemen. Ethische goedkeuring is verkregen van de Ain Shams Universiteit, de beoordelingscommissie Research Ethical Committee van de Faculteit Farmacie (REC ID# 48, 20 oktober 2021).

2.1.2. Het onderzoek werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de World Medical Association (WMA) die voldoen aan de Verklaring van Helsinki over ethische principes voor medisch onderzoek waarbij menselijke proefpersonen betrokken zijn, de herziene versie van juli 2018, waarbij alle deelnemende individuen de ethisch goedgekeurde geïnformeerde toestemming (IC) ondertekenden.

2.1.3. BC-patiëntengroepen. 90 vrouwelijke BC-patiënten namen als vrijwilliger deel aan de studie, waarbij de diagnose primaire naïeve (niet-gemetastaseerde) invasieve BC (46 patiënten) of gemetastaseerde BC (44 patiënten) werd gesteld. Patiënten werden willekeurig ingeschreven bij de afdeling Klinische Oncologie, Faculteit der Geneeskunde, Mansoura Universitaire Ziekenhuizen, Mansoura Universiteit, Mansoura, Egypte, na ondertekening van de IC.

2.1.4. BC-diagnose werd uitgevoerd met mammografie en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). De volledige geschiedenis werd verzameld en vastgelegd voor alle studiedeelnemers (n = 90).

Er werden bloedmonsters en de weefselparaffineblokken verzameld van degenen die aan de inclusiecriteria voldeden en de IC ondertekenden.

2.1.5. Klinische en pathologische kenmerken van patiënten. Voor alle BC-deelnemers werd de volledige ziekte-/kankergeschiedenis van de familie geregistreerd, evenals de diabetesstatus van de patiënt (ja vs. nee), het aantal zwangerschappen (minder of meer dan 2), de menopauzestatus (pre- vs. post-) en behandeling(en) ontvangen (neoadjuvante chemotherapie, adjuvante chemotherapie, endocriene therapie of borstamputatie). De individuele huidige kankerstatus van patiënten en de klinische beoordeling van de tumor, uitgevoerd aan de Faculteit der Geneeskunde, Mansoura University Hospital, Mansoura University, met behulp van de tumor-node-metastase (TNM)-categorisatie volgens de 8e editie van de American Joint Committee on Cancer ( AJCC) stadiëringshandleiding en de Bloom-Richardson-schaal voor histologische beoordeling (24), verzameld uit gegevensbestanden van patiënten, nadat een biopsie was genomen ten tijde van het chirurgische onderzoek/onderzoek in BC.

Immunohistochemie (IHC) resultaten voor de proliferatie-index Ki-67 (die laag of hoog is), de status van de oestrogeenreceptor (ER), de progesteronreceptor (PR) en de menselijke epidermale groeireceptor 2 (HER2/neu) (elk positief of negatief), body mass index (BMI) kg/m2 (normaal, overgewicht en obesitas 18,5-24,9, 25-29,9 en ≥30 kg/m2, respectievelijk) (25), de status van de lymfeklieren (LN) (geen N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) en de leeftijd in jaren werden allemaal verzameld. uit patiëntendossiers en in tabelvorm voor statistische analyse.

Moleculair BC-subtype (27) indien luminaal zoals (ER+ en/of PR+), HER-2-overexpressie (ER-, PR-, HER-2+), of drievoudig-negatief BC (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) en histologische BC-subtypes (28), ongeacht of er sprake was van invasief ductaal carcinoom (IDC) of niet, werden allemaal geregistreerd voor correlatieanalyse.

3. Methoden 3.1. Biochemische analyse 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 werd beoordeeld met behulp van Human CCR4 NOT transcriptiecomplex subeenheid 7 (CNOT7) ELISA Kit, Mybiosource, VS, volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden de standaarden en serummonsters van zowel niet-metastatische BC- als metastatische BC-groepen samen met CNOT7-HRP-conjugaat geïncubeerd in een met anti-CNOT7-antilichaam voorgecoate ELISA-plaat, geleverd door de fabrikant, gedurende een uur bij 37 ° C. Na de incubatieperiode werden de putjes gedecanteerd en vijf keer handmatig gewassen met behulp van een vooraf verdunde wasbuffer die door de fabrikant werd geleverd. Wells geïncubeerd met een substraat voor HRP-enzym gedurende een uur bij 37°C. Tenslotte werd een stopoplossing toegevoegd om de reactie te stoppen. De geproduceerde kleurintensiteit werd spectrofotometrisch gemeten bij 450 nm in een microplaatlezer. Er werd een standaardcurve uitgezet waarbij de kleurintensiteit (optische dichtheid (O.D.)) werd gerelateerd aan de concentratie van standaarden. De CNOT7-concentratie in elk monster werd geïnterpoleerd op basis van deze standaardcurve (aanvullend bestand).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 werd beoordeeld met behulp van Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, VS. Standaarden en monsters werden in de putjes van een ELISA-plaat gepipetteerd die vooraf was bekleed met een LAIR-1-specifiek antilichaam geleverd door de fabrikant. De plaat werd vervolgens afgedekt en 45 minuten bij 37°C geïncubeerd. gevolgd door een 5-voudige handmatige wasstap met behulp van wasbuffer die eerder was verdund. Een HRP-geconjugeerd detectie-antilichaam werd aan de plaat toegevoegd en deze werd opnieuw gedurende 30 minuten bij dezelfde temperatuur geïncubeerd. Daarna werd de plaat gewassen zoals eerder uitgelegd en gedurende 15 minuten geïncubeerd met chromogeenoplossingen. gevolgd door een laatste stap van het toevoegen van stopoplossing. De kleurintensiteit werd spectrofotometrisch gemeten bij 450 nm in een microplaatlezer. Er wordt een standaardcurve uitgezet die de intensiteit van de kleur (O.D.) relateert aan de concentratie van standaarden. De LAIR-1-concentratie in elk monster werd geïnterpoleerd op basis van deze standaardcurve (aanvullend bestand). Er werden standaarden bereid uit een voorraadoplossing en een standaardverdunningsmiddel geleverd door de fabrikant die een tweevoudige verdunningsreeks 3.1.1.3 produceerde. s. Insuline-ELISA Seruminsulinetest werd uitgevoerd met behulp van Hyperion Inc., Miami, FL, VS ELISA-kit. De kleurintensiteit van het testmonster is direct omgekeerd evenredig aan de insulineconcentratie. Het normale insulineniveau voor volwassenen is 0-25 mU/L.

3.1.2. Immunohistochemie 3.1.2.1. CNOT7 IHC-kleuringsprotocol Met behulp van paraffinecoupes gemonteerd op positief geladen objectglaasjes met behulp van de avidine-biotin-peroxidase-complex (ABC) techniek (29). Secties van elke groep werden behandeld met CNOT7 (M01) (ABNOVA, Cat# H00029883-M01, Monoklonaal antilichaam, Kloon 2F6) bij een verdunning van 1:25 voordat ze werden blootgesteld aan de chemicaliën die nodig zijn voor de ABC-methode (Vectastain ABC-HRP-kit, Vector laboratoria). Om antigeen-antilichaamcomplexen te detecteren, werd markerexpressie getagd met peroxidase en gekleurd met diaminobenzidine (DAB, vervaardigd door Sigma). Negatieve controles werden opgenomen met behulp van niet-immuun serum in plaats van de primaire of secundaire antilichamen. Leica-microscoop (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Zwitserland) werd gebruikt om met IHC gekleurde secties te evalueren (Leica Microsystems, Zwitserland).

3.1.2.2. Kwantitatieve evaluatie van CNOT7 IHC-resultaten "Oppervlak%" In elke seriële sectie van de geanalyseerde patiëntengroepen werden zes velden met hoog vermogen (x 400) met positieve bruine immunokleuring gekozen voor onderzoek. Het oppervlaktepercentage van de met CNOT7 gekleurde secties werd berekend met behulp van het Leica QWin 500 beeldanalysatorcomputersysteem (VK). Deze beeldanalysator omvatte een Leica-microscoop, een kleurenvideocamera, een kleurenmonitor en een harde schijf van een Leica IBM-personal computer, gekoppeld aan de microscoop en beheerd door Leica QWin 500-software.

Gegevens over oppervlaktepercentage werden statistisch gerapporteerd in termen van gemiddelde en standaardafwijking van het gemiddelde (gemiddelde ± S.E.M) voor acht beelden van vier niet-gemetastaseerde monsters en vier metastatische monsters.

3.2. In silico Bio-informatica-analyse 3.2.1. Borstkanker Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Bijgewerkt op 28 juni 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) om de correlatie tussen CNOT7 en LAIR1 te onderzoeken.

3.2.2. Functiemodule van LinkedOmics gebruikt om analyse uit te voeren van het biologische proces van Gene Ontology (GO_BP) met gensetverrijkingsanalyse (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Gen-gen-interacties en routes van in silico samengestelde DB's en tekstmining Via Genome Browser voor doelgenen met behulp van University of California Santa Cruiz (UCSC) (32) Genomics-instituut http://genome.ucsc.edu/index.html De LAIR1- en CNOT7-geneninteracties werden opgehaald, met vermelding van bekende remmende geneesmiddelen van DrugBank.

3.2.4. Protein-Protein Interaction (PPI) uit de Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) database versie 11.5 https://string-db.org/ die interacties voorspelt op basis van relevante experimentele gegevens, sequentieresultaten en literatuur uit >1100 volledig gesequenced organisme (33). Betreden op 20 januari 2023 om LAIR-1-interagerende eiwitten te onderzoeken.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Onderzoek naar genexpressiepatronen in normale en tumorweefsels (GENT2) met overleving http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Moleculair koppelen: 3.3.1. Bereiding van de eiwitstructuren van LAIR-1 en CNOT7 https://www.protocols.io/view/proteïne-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Uit de eiwitdatabank (PDB) https:// www.rcsb.org/search de kristalstructuur van Human LAIR-1 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Na het laden van de structuren in een moleculaire werkomgeving (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Geïntegreerd Computer-Aided Molecular Design Platform, ze werden voorbereid met behulp van de standaardparameters in het 'QuickPrep Panel', inclusief de verwijdering van watermoleculen, het toevoegen van waterstofatomen aan de eiwitstructuur, het aanpassen van de protonatietoestanden en het garanderen van energieminimalisatie van de eiwitstructuren met Amber10 :EHT-krachtveld.

Omdat deze kristalstructuren met geen enkele ligand waren gecokristalliseerd, werd MOE SiteFinder, een programma voor analyse van bindingsplaatsen uitgerust in de MOE, gebruikt om de mogelijke bindingsplaatsen te voorspellen. Deze zakken worden gerangschikt op basis van hun neiging tot ligandbinding (PLB). CNOT7 is een receptor zonder beschikbare PDB-gecokristalliseerde structuur, daarom gebruikten de onderzoekers de MOE siteFinder-tool om te helpen bij ons onderzoek, waarbij de gids uit eerdere literatuur verschillende essentiële aminozuurresiduen rapporteerde die betrokken zijn bij ligand-CNOT7-eiwitinteracties zoals Glu247, Tyr260 en Glu278 (34,35) zijn als relatief significant geïdentificeerd.

3.3.2. Curatie van ligandendatasets Het in MOE geïmplementeerde 'builder-programma' werd gebruikt om zes liganden in het onderzoek te modelleren; Vitamine E, Colchicine, Prodigiosin, Riboflavine, Telmisartan en Pioglitazon, waarbij alle mogelijke conformaties bij de fysiologische pH werden verkregen.

3.3.3. Dockingsimulaties Het docken van de verkregen conformaties van de zes liganden werd uitgevoerd met behulp van plaatsings- en verfijningsalgoritmen van het MOE-programma. Bij het aanvankelijk koppelen van de moleculen op de actieve plaatsen werd gebruik gemaakt van de 'Triangle Matcher'-plaatsingsmethode en de'London dG'-scoringsfunctie. Verdere verfijning van de dockinghoudingen na plaatsing werd bereikt door gebruik te maken van de 'GBVI/WSA dG'-scoremethode. De houdingen met minimale energie werden gebruikt voor visualisatie van de bindingsinteracties en de bezetting van de bindingsplaats van de receptoren.

3.4. Statistische analyse 3.4.1. De verzamelde gegevens werden geregistreerd en geanalyseerd met behulp van de Statistical Package for Social Science-software (SPSS, versie 17, Chicago, IL, VS).

3.4.2. Kwalitatieve gegevens werden gepresenteerd als frequenties (n) en percentages (%). 3.4.3. Test voor kwantitatieve gegevensnormaliteit werd uitgevoerd met behulp van de Shapiro-Wilk-calculator. Normaal verdeelde variabelen werden weergegeven als gemiddelde ± SEM en geanalyseerd met behulp van twee steekproeven, onafhankelijke Students' t-testen voor vergelijking van twee groepen. Niet-normaal verdeelde gegevens werden gepresenteerd als medianen (interkwartielbereiken als eerste tot derde kwartiel of 25e-75e kwartiel) en geanalyseerd met behulp van de Mann-Whitney (U)-test.

3.4.4. De ROC-curve werd uitgevoerd om de beste afkappunten te detecteren om de CNOT7- en LAIR-1-serumniveaus in subgroepen met lage en hoge expressie te categoriseren.

3.4.5. De Chi-kwadraattest werd gebruikt om het verband tussen CNOT7-serumniveaus en klinisch-pathologische parameters te evalueren. De Pearson-correlatietest werd gebruikt om het verband tussen parametrische variabelen te beoordelen. Punt-biseriële correlaties werden gebruikt om de correlatie tussen parameters te bepalen wanneer een ervan een dichotome variabele was.

3.4.6. Het significantieniveau werd vastgesteld op P < 0,05 en het betrouwbaarheidsniveau (CI) of interval op respectievelijk 95% en 5%.