CCR4-NOT 复合物亚基 7 表达在转移性乳腺癌自然杀伤细胞抵抗中的意义 (CCR4-NOT)

1. 简介 1.1。 研究问题。 乳腺癌 (BC) 是女性癌症死亡的主要原因 (1,2)。 这种死亡的主要原因是转移扩散到其他器官 (3)。 当肿瘤细胞获得侵袭性特征 (4) 和逃避抗肿瘤免疫的能力时，就会发生转移；先天性和适应性免疫反应对于肿瘤控制很重要 (5,6)。 据报道，BC 进展会导致外周血自然杀伤 (NK) 细胞成熟和细胞毒功能严重受损 (7)。 多项基因表达谱研究表明，更好的结果与含有 NK 细胞的强细胞毒性浸润相关 (8,9)。 这些数据表明 BC 进展与 NK 细胞、T 细胞和 B 细胞的抗肿瘤免疫效率有关。 然而，BC 进展如何影响外周 NK 细胞表型尚未得到充分研究。

NK 细胞的活性是通过 NK 细胞上存在的激活和抑制受体来确定的，这些受体在靶细胞（本文中为肿瘤细胞）识别过程中被触发，分别诱导正向或负向细胞信号传导途径。 这些相反信号的整合决定了 NK 细胞激活权重 (10)。 最近的研究表明，肿瘤微环境 (TME) 中经常发现的几种分子，特别是抑制因子，可以急剧损害 NK 细胞的表型和功能 (11,12)，导致激活 NK 细胞受体的表达减少和 NK 细胞受体的表达增加抑制性受体（如之前在 HCC 临床血液样本中检测到的 LAIR-1）T 细胞毒性细胞 (13)。 这些可能促进 BC 进展，并与 NK 细胞和 T 细胞或 B 细胞遇到的免疫细胞细胞毒性功能下降相关 (14)。

1.2. 目的和目标。 为了探讨 CNOT7 在 BC 转移中与免疫细胞抵抗相关的作用，研究人员尝试测量埃及女性 BC 患者队列中 CNOT7 的血清水平与临床病理参数的关系。 测量了分类为转移性与非转移性肿瘤以及邻近非肿瘤组织边缘的 BC 组织样本中的 CNOT7 组织表达。 进一步地，量化了 NK 细胞上的抑制性受体，即： LAIR-1 血清水平，其过度表达与侵袭性 BC 特征和不良临床结果相关 (22)，表现为 TNM。 CNOT7 与 LAIR-1 血液水平的相关性有待临床评估，并通过生物信息学数据库搜索和计算机分析进行确认或推出。 研究人员正在寻找BC转移机制，而不仅仅是探索CNOT7或LAIR1血液水平，因此，通过CNOT7分子对接或通过阻断其下游通路或效应基因-基因网络相互作用来寻找更多的治疗选择，或者作为潜在的有希望的治疗方案。 其中，这些途径和相互作用将从 KEGG 途径搜索中检索，通过文本挖掘相互作用或搜索计算机生物信息学数据库来进一步解决。

2.1. 2.1.1 研究参与者 道德批准和知情同意参与。 伦理批准已获得艾因夏姆斯大学药学院审查委员会研究伦理委员会（REC ID# 48，2021 年 10 月 20 日）。

2.1.2. 该研究是根据世界医学协会 (WMA) 的指南进行的，该指南履行了《赫尔辛基涉及人类受试者的医学研究伦理原则宣言》（2018 年 7 月修订版），所有参与个人都签署了经伦理批准的知情同意书 (IC)。

2.1.3. BC 省患者团体。 90 名自愿参与该研究的女性 BC 患者被诊断患有原发性（非转移性）侵袭性 BC（46 名患者）或转移性 BC（44 名患者）。 签署IC后，患者从埃及曼苏拉曼苏拉大学医院医学院临床肿瘤科随机入组。

2.1.4. BC 诊断通过乳房 X 光检查和磁共振成像 (MRI) 进行。 收集并记录所有研究参与者 (n = 90) 的完整历史记录。

为符合纳入标准并签署 IC 的人员采集血样和组织石蜡块。

2.1.5。 患者的临床和病理特征。 对于所有 BC 参与者，记录了完整的家族疾病/癌症史，以及患者的糖尿病状况（是或否）、怀孕次数（少于或超过 2 次）、绝经状态（绝经前与绝经后）以及接受的治疗（新辅助化疗、辅助化疗、内分泌治疗或乳房切除术）。 患者个人当前癌症状况和肿瘤临床评估，在曼苏拉大学曼苏拉大学医院医学院进行，根据美国癌症联合委员会第 8 版使用肿瘤-淋巴结-转移 (TNM) 分类（ AJCC）分期手册和 Bloom-Richardson 组织学分级量表（24）是在 BC 手术探查/检查时进行活检后从患者数据文件中收集的。

增殖指数 Ki-67（低或高）、雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR) 状态和人表皮生长受体 2 (HER2/neu)（均为阳性或阳性）的免疫组织化学 (IHC) 结果阴性），体重指数（BMI）kg/m2（正常、超重和肥胖18.5-24.9， 分别收集了 25-29.9 和 ≥30 kg/m2）(25)、淋巴结 (LN) 状态（无 N0、N1-3、N4-9、≥ 10）(26) 和年龄（以岁为单位）从患者档案中提取并制成表格进行统计分析。

分子 BC 亚型 (27) 如果管腔样（ER+ 和/或 PR+）、HER-2 过表达（ER-、PR-、HER-2+）或三阴性 BC (TNBC)（ER-、PR-、HER -2-) 和组织学 BC 亚型 (28)（无论是否为浸润性导管癌 (IDC)）均被记录用于相关分析。

3. 方法 3.1。 生化分析 3.1.1。 ELISA 3.1.1.1。 CNOT7 ELISA CNOT7 使用人 CCR4 NOT 转录复合物亚基 7 (CNOT7) ELISA 试剂盒（Mybiosource，美国）按照制造商的说明进行评估。 简而言之，将非转移性 BC 和转移性 BC 组的标准品和血清样品与 CNOT7-HRP 缀合物一起在制造商提供的抗 CNOT7 抗体预包被 ELISA 板中在 37°C 下孵育 1 小时。 孵育期结束后，将孔倒出并使用制造商提供的预稀释洗涤缓冲液手动洗涤五次。 将孔与 HRP 酶底物在 37°C 下孵育一小时。 最后，加入终止液以终止反应。 在酶标仪中以分光光度法在 450 nm 处测量产生的颜色强度。 绘制一条标准曲线，将颜色强度（光密度（O.D.））与标准品的浓度联系起来。 每个样品中的 CNOT7 浓度是从该标准曲线（补充文件）中插值得出的。

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA 使用人类 LAIR-1 ELISA 试剂盒（Mybiosource，美国）评估 LAIR-1。 将标准品和样品移入 ELISA 板的孔中，该板预先涂有制造商提供的 LAIR-1 特异性抗体。 然后将板盖上并在 37°C 下孵育 45 分钟。 然后使用预先稀释的洗涤缓冲液进行 5 次手动洗涤步骤。 将 HRP 缀合的检测抗体添加到板中，并在相同温度下再次孵育 30 分钟。 然后，如前所述洗涤板并与显色剂溶液一起孵育 15 分钟。 接下来是添加终止溶液的最后一步。 在酶标仪中以分光光度法在 450 nm 处测量颜色强度。 绘制一条标准曲线，将颜色强度 (O.D.) 与标准品浓度联系起来。 每个样品中的 LAIR-1 浓度是从该标准曲线（补充文件）中插值得出的。 标准品由制造商提供的储备溶液和标准稀释剂制备，生产 2 倍稀释系列 3.1.1.3。 s.胰岛素ELISA 使用Hyperion Inc.，Miami，FL，USA ELISA试剂盒进行血清胰岛素测定。 测试样品的颜色强度与其胰岛素浓度直接成反比。 成人正常胰岛素水平范围为 0-25 mU/L。

3.1.2. 免疫组织化学3.1.2.1。 CNOT7 IHC 染色方案 使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物 (ABC) 技术将石蜡切片安装在带正电的载玻片上 (29)。 每组切片均以 1:25 稀释度用 CNOT7 (M01)（ABNOVA，目录号 H00029883-M01，单克隆抗体，克隆 2F6）处理，然后暴露于 ABC 方法所需的化学物质（Vectastain ABC-HRP 试剂盒，Vector）实验室）。 为了检测抗原-抗体复合物，标记物表达用过氧化物酶标记并用二氨基联苯胺(DAB，由Sigma制造)着色。 使用非免疫血清代替一抗或二抗进行阴性对照。 使用 Leica 显微镜 (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Switzerland) 评估 IHC 染色切片 (Leica Microsystems, Switzerland)。

3.1.2.2. CNOT7 IHC 结果的定量评估“面积%” 在分析的患者组的每个连续切片中，选择具有阳性棕色免疫染色的六个高倍视野（x 400）进行检查。 使用 Leica QWin 500 图像分析仪计算机系统（英国）计算 CNOT7 染色切片的面积％。 该图像分析仪需要一台徕卡显微镜、一台彩色摄像机、一台彩色显示器和一台与显微镜连接并由徕卡 QWin 500 软件管理的徕卡 IBM 个人计算机的硬盘。

对于来自四个非转移性样品和四个转移性样品的八个图像，以平均值和平均值标准误差（平均值±S.E.M）统计报告面积％数据。

3.2. 计算机生物信息学分析 3.2.1。 乳腺癌基因表达矿工 v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) 于 2023 年 6 月 28 日更新。

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) 探索 CNOT7 和 LAIR1 之间的相关性。

3.2.2. LinkedOmics 的功能模块用于通过基因集富集分析 (GSEA) 进行基因本体生物过程 (GO_BP) 分析 http://www.linkedomics.org/ (31)。

3.2.3. 使用加州大学圣克鲁斯分校 (UCSC) (32) 基因组研究所通过基因组浏览器对目标基因进行计算机模拟数据库和文本挖掘的基因间相互作用和途径 http://genome.ucsc.edu/index.html 检索了 LAIR1 和 CNOT7 基因的相互作用，并提到了 DrugBank 中已知的抑制剂药物。

3.2.4. 蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI)，来自相互作用基因/蛋白质检索搜索工具 (STRING) 数据库版本 11.5 https://string-db.org/，它根据相关实验数据、测序结果和文献预测相互作用>1100 个完全测序的生物体 (33)。 于 2023 年 1 月 20 日访问，以探索 LAIR-1 相互作用蛋白。

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5。 探索正常组织和肿瘤组织 (GENT2) 的基因表达模式与生存 http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. 分子对接：3.3.1。 LAIR-1 和 CNOT7 蛋白质结构的制备 https://www.protocols.io/view/ Protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 来自蛋白质数据库 (PDB) https:// www.rcsb.org/search 人类 LAIR-1 的晶体结构（PDB ID：3RP1） https://www.rcsb.org/struct/3RP1 在分子操作环境 (MOE) 中加载结构后 https://www.chemcomp.com/Products.htm 集成计算机辅助分子设计平台，使用“QuickPrep Panel”中的默认参数进行制备，包括去除水分子、向蛋白质结构添加氢原子、调整质子化状态以及使用 Amber10 确保蛋白质结构的能量最小化：EHT 力场。

由于这些晶体结构不与任何配体共结晶，因此使用 MOE SiteFinder（MOE 中配备的结合位点分析程序）来预测可能的结合位点。 这些口袋根据其配体结合 (PLB) 倾向进行排名。 CNOT7 是一种没有可用的 PDB 共结晶结构的受体，因此，研究人员使用 MOE siteFinder 工具来帮助我们的研究，并以以前的文献为指导，报告了几个参与配体-CNOT7 蛋白相互作用的必需氨基酸残基，如 Glu247、 Tyr260、Glu278 (34,35) 已被确定为相对重要。

3.3.2. 配体数据集管理 MOE 中实施的“构建程序”用于对研究中的六种配体进行建模；维生素 E、秋水仙碱、灵菌红、核黄素、替米沙坦和吡格列酮，其中获得了生理 pH 下所有可能的构象。

3.3.3. 对接模拟使用MOE程序的放置和细化算法对所获得的六种配体的构象进行对接。 分子在活性位点的初始对接使用“三角匹配器”放置方法和“伦敦 dG”评分函数。 通过使用“GBVI/WSA dG”评分方法，实现了对接姿势的进一步放置后细化。 具有最小能量的姿势用于可视化结合相互作用以及受体结合位点的占据。

3.4. 3.4.1. 统计分析 使用社会科学统计软件软件（SPSS，版本 17，芝加哥，伊利诺伊州，美国）记录和分析收集的数据。

3.4.2. 定性数据以频率 (n) 和百分比 (%) 表示。 3.4.3. 使用夏皮罗-威尔克计算器进行定量数据正态性检验。 正态分布变量表示为平均值±S.E.M，并使用两个样本独立学生 t 检验进行分析，以比较两组。 非正态分布的数据以中位数表示（四分位数范围为第一至第三四分位数或第 25-75 个四分位数）并使用 Mann-Whitney (U) 检验进行分析。

3.4.4. 进行ROC曲线以检测将CNOT7和LAIR-1血清水平分类为低表达亚组和高表达亚组的最佳截止点。

3.4.5。 卡方检验用于评估 CNOT7 血清水平与临床病理参数之间的关联。 皮尔逊相关性检验用于评估参数变量之间的关联。 当参数之一是二分变量时，使用点二列相关性来确定参数之间的相关性。

3.4.6。 显着性水平设置为 P < 0.05，置信水平 (C.I) 或区间分别设置为 95% 和 5%。