Implikacja ekspresji podjednostki 7 kompleksu CCR4-NOT w oporności komórek NK w przerzutowym raku piersi (CCR4-NOT)

1. Wprowadzenie 1.1. Problem badawczy. Rak piersi (BC) jest główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów u kobiet (1,2). Główną przyczyną tej śmiertelności jest rozsiew przerzutów do innych narządów (3). Do przerzutów dochodzi, gdy komórki nowotworowe nabywają cechy inwazyjne (4) i zdolność ucieczki przed odpornością przeciwnowotworową; wrodzone i nabyte odpowiedzi immunologiczne ważne dla kontroli nowotworu (5,6). Donoszono, że progresji BC towarzyszy poważne upośledzenie dojrzewania naturalnych komórek zabójczych (NK) krwi obwodowej i funkcji cytotoksycznych (7). Kilka badań profilowania ekspresji genów wykazało, że lepszy wynik jest związany z silnym naciekiem cytotoksycznym zawierającym komórki NK (8,9). Dane te sugerują, że progresja BC jest powiązana z przeciwnowotworową skutecznością immunologiczną komórek NK, komórek T i komórek B. Jednakże wpływ progresji BC na fenotyp obwodowych komórek NK nie jest obszernie zbadany.

Aktywność komórek NK określa się poprzez aktywację i hamowanie receptorów obecnych na komórkach NK, które są wyzwalane podczas rozpoznawania komórki docelowej (tutaj komórki nowotworowej), indukując odpowiednio pozytywny lub negatywny szlak sygnalizacji komórkowej. Integracja tych przeciwnych sygnałów określa wagę aktywacji komórek NK (10). Niedawne badania wykazały, że kilka cząsteczek, w szczególności czynniki hamujące, często występujące w mikrośrodowisku nowotworu (TME), może gwałtownie upośledzać fenotyp i funkcje komórek NK (11,12), powodując zmniejszoną ekspresję aktywujących receptorów komórek NK i zwiększoną ekspresję receptory hamujące (takie jak LAIR-1, który wykryto wcześniej w próbkach krwi klinicznej HCC, w komórkach T-cytotoksycznych (13). Mogą one sprzyjać progresji BC i korelują ze zmniejszoną funkcją cytotoksyczną komórek odpornościowych, na którą napotykają komórki NK, komórki T lub komórki B (14).

1.2. Cel i zadania. Aby zbadać rolę CNOT7 związaną z opornością komórek odpornościowych w przerzutach BC, badacze podjęli próbę pomiaru poziomów CNOT7 w surowicy w kohorcie egipskich pacjentek z BC w odniesieniu do parametrów kliniczno-patologicznych. Zmierzono ekspresję tkanki CNOT7 w próbkach tkanki BC sklasyfikowanych jako guz przerzutowy w porównaniu z nowotworem nieprzerzutowym wraz z sąsiadującym marginesem tkanki nienowotworowej. Ponadto określono ilościowo receptor hamujący na komórkach NK, a mianowicie; Poziomy LAIR-1 w surowicy, których nadekspresja byłaby powiązana z agresywnymi cechami BC i niekorzystnymi wynikami klinicznymi (22) objawiającymi się jako TNM. Korelacja CNOT7 z poziomem LAIR-1 we krwi ma zostać oceniona klinicznie i potwierdzona lub wdrożona poprzez przeszukiwanie bioinformatycznych baz danych i analizę in silico. Według badaczy poszukują mechanizmu przerzutów BC, a nie tylko badania poziomów CNOT7 lub LAIR1 we krwi, dlatego też szukają większej liczby opcji terapeutycznych poprzez dokowanie molekularne CNOT7 lub blokowanie jego dalszych szlaków lub interakcji sieci gen-efektor, co jest potencjalnie obiecujące możliwości leczenia. Gdzie te ścieżki i interakcje zostaną odzyskane z wyszukiwania ścieżek KEGG, następnie omówione poprzez interakcje z eksploracją tekstu lub przeszukiwanie wyselekcjonowanych bioinformatycznych baz danych in silico.

2.1. Uczestnicy badania 2.1.1. Zgoda etyczna i świadoma zgoda na udział. Uzyskano zgodę etyczną od Komisji Etycznej ds. Badań Uniwersytetu Ain Shams Uniwersytetu Ain Shams (REC ID nr 48, 20 października 2021 r.).

2.1.2. Badanie przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Światowego Stowarzyszenia Medycznego (WMA) zgodnymi z Deklaracją Helsińską dotyczącą zasad etycznych dotyczących badań medycznych z udziałem ludzi, poprawioną w wersji z lipca 2018 r., gdzie wszystkie uczestniczące osoby podpisały etycznie zatwierdzoną świadomą zgodę (IC).

2.1.3. Grupy pacjentów BC. Do badania zgłosiło się 90 pacjentek z BC, które zgłosiły się na ochotnika, u których zdiagnozowano albo pierwotnie naiwną (bez przerzutów), inwazyjną BC (46 pacjentów), albo BC z przerzutami (44 pacjentów). Pacjenci byli włączani losowo z Oddziału Onkologii Klinicznej Wydziału Lekarskiego Szpitali Uniwersyteckich Mansoura Uniwersytetu Mansoura w Mansoura w Egipcie po podpisaniu IC.

2.1.4. Diagnozę BC przeprowadzono za pomocą mammografii i rezonansu magnetycznego (MRI). Od wszystkich uczestników badania zebrano i zarejestrowano pełny wywiad (n = 90).

Od osób, które spełniły kryteria włączenia i podpisały IC, pobrano próbki krwi i bloki parafiny tkankowej.

2.1.5. Cechy kliniczne i patologiczne pacjentów. W przypadku wszystkich uczestników BC rejestrowano pełną historię chorób/nowotworów w rodzinie, jak również stan cukrzycowy pacjentek (tak vs nie), liczbę ciąż (mniej lub więcej niż 2), stan menopauzalny (przed i po) oraz otrzymane leczenie (chemioterapia neoadjuwantowa, chemioterapia uzupełniająca, terapia hormonalna lub mastektomia). Indywidualny aktualny stan nowotworu i ocena kliniczna nowotworu dokonana na Wydziale Lekarskim Szpitala Uniwersyteckiego Mansoura Uniwersytetu Mansoura, przy użyciu kategoryzacji nowotworu-węzła-przerzutów (TNM) zgodnie z 8. edycją Amerykańskiego Wspólnego Komitetu ds. Raka (American Joint Committee on Cancer) ( AJCC) oraz podręcznik oceny stopnia zaawansowania choroby i skala Blooma-Richardsona do oceny histologicznej (24) zebrane z dokumentacji pacjentów, po wykonaniu biopsji podczas eksploracji/badania chirurgicznego BC.

Wyniki immunohistochemii (IHC) dotyczące wskaźnika proliferacji Ki-67 (niskiego lub wysokiego), statusu receptora estrogenowego (ER), receptora progesteronowego (PR) i ludzkiego receptora wzrostu naskórka 2 (HER2/neu) (każdy dodatni lub ujemny), wskaźnik masy ciała (BMI) kg/m2 (w normie, z nadwagą i otyłością 18,5-24,9, odpowiednio 25–29,9 i ≥30 kg/m2) (25), stan węzłów chłonnych (LN) (brak N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) i wiek w latach. z dokumentacji pacjentów i zestawiono w tabeli do analizy statystycznej.

Podtyp molekularny BC (27), jeśli jest podobny do luminalnego (ER+ i/lub PR+), nadekspresja HER-2 (ER-, PR-, HER-2+) lub potrójnie ujemny BC (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) i podtypy histologiczne BC (28), czy to inwazyjny rak przewodowy (IDC), czy nie, zarejestrowano do analizy korelacji.

3. Metody 3.1. Analiza biochemiczna 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 oceniano przy użyciu zestawu ELISA kompleksu transkrypcyjnego Human CCR4 NOT podjednostki 7 (CNOT7), Mybiosource, USA, zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, standardy i próbki surowicy zarówno grupy BC bez przerzutów, jak i grupy BC z przerzutami inkubowano razem z koniugatem CNOT7-HRP na dostarczonej przez producenta płytce ELISA pokrytej przeciwciałem anty-CNOT7 przez godzinę w temperaturze 37°C. Po okresie inkubacji dołki zdekantowano i przemyto pięciokrotnie ręcznie, stosując wstępnie rozcieńczony bufor do przemywania dostarczony przez producenta. Studzienki inkubowano z substratem dla enzymu HRP przez godzinę w temperaturze 37°C. Na koniec dodano roztwór zatrzymujący, aby zatrzymać reakcję. Intensywność powstałego koloru mierzono spektrofotometrycznie przy 450 nm w czytniku mikropłytek. Wykreślono krzywą standardową odnoszącą się do intensywności koloru (gęstość optyczna (OD)) do stężenia standardów. Stężenie CNOT7 w każdej próbce interpolowano z tej krzywej standardowej (plik uzupełniający).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 oceniano przy użyciu zestawu Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, USA. Standardy i próbki odpipetowano do dołków płytki ELISA wstępnie pokrytej przeciwciałem specyficznym dla LAIR-1 dostarczonym przez producenta. Następnie płytkę przykryto i inkubowano w temperaturze 37°C przez 45 minut. po czym następuje etap 5-krotnego ręcznego przemywania przy użyciu buforu płuczącego, który został wcześniej rozcieńczony. Do płytki dodano przeciwciało detekcyjne skoniugowane z HRP i inkubowano je ponownie w tej samej temperaturze przez 30 minut. Następnie płytkę przemyto jak wyjaśniono wcześniej i inkubowano z roztworami chromogenu przez 15 minut. po którym następuje ostatni etap dodawania roztworu zatrzymującego. Intensywność zabarwienia mierzono spektrofotometrycznie przy 450 nm w czytniku mikropłytek. Wykreślana jest krzywa wzorcowa odnosząca się do intensywności koloru (OD) i stężenia wzorców. Stężenie LAIR-1 w każdej próbce interpolowano z tej krzywej standardowej (plik uzupełniający). Wzorce przygotowano z roztworu podstawowego i rozcieńczalnika wzorcowego dostarczonego przez producenta, wytwarzając serię 2-krotnych rozcieńczeń 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Oznaczenie insuliny w surowicy przeprowadzono przy użyciu zestawu Hyperion Inc., Miami, Floryda, USA ELISA. Intensywność zabarwienia próbki testowej jest bezpośrednio odwrotnie proporcjonalna do stężenia insuliny. Normalny poziom insuliny dla dorosłych wynosi 0–25 mU/l.

3.1.2. Immunohistochemia 3.1.2.1. Protokół barwienia CNOT7 IHC Przy użyciu skrawków parafinowych zamontowanych na dodatnio naładowanych szkiełkach przy użyciu techniki kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza (ABC) (29). Skrawki z każdej grupy traktowano CNOT7 (M01) (ABNOVA, nr kat. H00029883-M01, przeciwciało monoklonalne, Clone 2F6) w rozcieńczeniu 1:25 przed wystawieniem na działanie substancji chemicznych niezbędnych do metody ABC (zestaw Vectastain ABC-HRP, Vector laboratoria). Aby wykryć kompleksy antygen-przeciwciało, ekspresję markera znakowano peroksydazą i barwiono diaminobenzydyną (DAB, wyprodukowaną przez Sigma). Do kontroli negatywnej włączono surowicę nieimmunologiczną zamiast przeciwciał pierwotnych lub wtórnych. Do oceny skrawków barwionych IHC (Leica Microsystems, Szwajcaria) użyto mikroskopu Leica (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Szwajcaria).

3.1.2.2. Ilościowa ocena wyników CNOT7 IHC „Powierzchnia %” W każdym seryjnym przekroju analizowanych grup pacjentów do badania wybrano sześć pól o dużej mocy (x 400) z dodatnim brązowym barwieniem immunologicznym. Procent powierzchni skrawków wybarwionych CNOT7 obliczono przy użyciu systemu komputerowego analizatora obrazu Leica QWin 500 (Wielka Brytania). Ten analizator obrazu składał się z mikroskopu Leica, kolorowej kamery wideo, kolorowego monitora i dysku twardego komputera osobistego Leica IBM połączonego z mikroskopem i zarządzanego przez oprogramowanie Leica QWin 500.

Dane dotyczące % powierzchni przedstawiono statystycznie w kategoriach średniej i błędu standardowego średniej (średnia ± S.E.M) dla ośmiu obrazów z czterech próbek bez przerzutów i czterech próbek z przerzutami.

3.2. In silico Analiza bioinformatyczna 3.2.1. Rak piersi Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Zaktualizowano 28 czerwca 2023 r.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30), aby zbadać korelację między CNOT7 i LAIR1.

3.2.2. Moduł funkcyjny LinkedOmics służący do przeprowadzania analizy procesu biologicznego Gene Ontology (GO_BP) z analizą wzbogacania zestawu genów (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Interakcje i ścieżki gen-gen z baz danych wyselekcjonowanych in silico i eksploracja tekstu za pośrednictwem przeglądarki Genome Browser w poszukiwaniu genów docelowych przy użyciu Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruiz (UCSC) (32) Instytut genomiki http://genome.ucsc.edu/index.html Odzyskano interakcje genów LAIR1 i CNOT7, wymieniając znane leki hamujące z DrugBank.

3.2.4. Interakcja białko-białko (PPI) z bazy danych Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) wersja 11.5 https://string-db.org/, która przewiduje interakcje na podstawie odpowiednich danych eksperymentalnych, wyników sekwencjonowania i literatury z >1100 w pełni zsekwencjonowanych organizmów (33). Dostęp: 20 stycznia 2023 r. w celu zbadania białek oddziałujących z LAIR-1.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Badanie wzorców ekspresji genów w tkankach prawidłowych i nowotworowych (GENT2) pod kątem przeżycia http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Dokowanie molekularne: 3.3.1. Przygotowanie struktur białkowych LAIR-1 i CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Z banku danych o białkach (PDB) https:// www.rcsb.org/search struktura krystaliczna ludzkiego LAIR-1 (identyfikator PDB: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Po załadowaniu struktur w molekularnym środowisku operacyjnym (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Zintegrowaną Platformę Komputerowego Wspomagania Projektowania Molekularnego przygotowano przy użyciu domyślnych parametrów w „Panelu QuickPrep”, obejmujących usuwanie cząsteczek wody, dodanie atomów wodoru do struktury białka, dostosowanie stanów protonowania i zapewnienie minimalizacji energii struktur białkowych za pomocą Amber10 :Pole siłowe EHT.

Ponieważ te struktury krystaliczne nie były kokrystalizowane z żadnymi ligandami, do przewidywania możliwych miejsc wiązania wykorzystano program MOE SiteFinder do analizy miejsc wiązania wyposażony w MOE. Kieszenie te są uszeregowane na podstawie ich skłonności do wiązania ligandu (PLB). CNOT7 jest receptorem bez dostępnej struktury ko-krystalizowanej PDB, dlatego badacze wykorzystali narzędzie MOE siteFinder do pomocy w naszym badaniu, zgodnie z wytycznymi z poprzedniej literatury opisującej kilka niezbędnych reszt aminokwasowych zaangażowanych w interakcje ligand-białko CNOT7, takie jak Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) uznano za stosunkowo istotne.

3.3.2. Przeglądanie zbioru danych o ligandach Do modelowania sześciu ligandów w badaniu wykorzystano „program konstruktora” wdrożony w MOE; Witamina E, Kolchicyna, Prodigiozyna, Ryboflawina, Telmisartan i Pioglitazon, gdzie uzyskano wszystkie możliwe konformacje przy fizjologicznym pH.

3.3.3. Symulacje dokowania Dokowanie uzyskanych konformacji sześciu ligandów przeprowadzono przy użyciu algorytmów rozmieszczania i udokładniania programu MOE. Do wstępnego dokowania cząsteczek w miejscach aktywnych wykorzystano metodę umieszczania „Triangle Matcher” i funkcję punktacji „London dG”. Dalsze udoskonalanie pozycji dokowania po umieszczeniu w miejscu dokowania osiągnięto za pomocą metody punktacji „GBVI/WSA dG”. Do wizualizacji interakcji wiążących oraz zajętości miejsca wiązania receptorów wykorzystano pozy z minimalną energią.

3.4. Analiza statystyczna 3.4.1. Zebrane dane rejestrowano i analizowano przy użyciu oprogramowania Statistical Package for Social Science (SPSS, wersja 17, Chicago, IL, USA).

3.4.2. Dane jakościowe przedstawiono jako częstości (n) i procenty (%). 3.4.3. Test normalności danych ilościowych przeprowadzono za pomocą kalkulatora Shapiro-Wilka. Zmienne o rozkładzie normalnym przedstawiono jako średnią ± S.E.M i analizowano przy użyciu niezależnego testu t-Studenta dla dwóch próbek w celu porównania dwóch grup. Dane o rozkładzie normalnym przedstawiono jako mediany (przedziały międzykwartylowe jako kwartyl od pierwszego do trzeciego lub kwartyl od 25. do 75.) i analizowano za pomocą testu Manna-Whitneya (U).

3.4.4. Krzywą ROC wykonano w celu wykrycia najlepszych punktów odcięcia w celu sklasyfikowania poziomów CNOT7 i LAIR-1 w surowicy na podgrupy o niskiej i wysokiej ekspresji.

3.4.5. Do oceny związku pomiędzy poziomami CNOT7 w surowicy a parametrami kliniczno-patologicznymi zastosowano test Chi-kwadrat. Do oceny związku pomiędzy zmiennymi parametrycznymi wykorzystano test korelacji Pearsona. Do określenia korelacji pomiędzy parametrami, gdy jeden z nich był zmienną dychotomiczną, wykorzystano korelacje punktowo-biseryjne.

3.4.6. Poziom istotności ustalono na poziomie P<0,05, a poziom ufności (CI) lub przedział odpowiednio na poziomie 95% i 5%.