Implikation av CCR4-NOT komplex subenhet 7 uttryck i naturliga mördarcellsresistens vid metastaserad bröstcancer (CCR4-NOT)

1. Inledning 1.1. Forskningsproblem. Bröstcancer (BC) är den primära orsaken till cancerdöd hos kvinnor (1,2). Den främsta orsaken till denna dödlighet är metastatisk spridning till andra organ (3). Metastas uppstår när tumörceller får invasiva egenskaper (4) och förmågan att fly från antitumörimmunitet; medfödda och adaptiva immunsvar viktiga för tumörkontroll (5,6). Stor försämring av perifert blods naturliga mördare (NK) cellmognad och cytotoxiska funktioner rapporterades följa med BC-progression (7). Flera studier av genuttrycksprofilering har visat att ett bättre resultat är associerat med ett starkt cytotoxiskt infiltrat innehållande NK-celler (8,9). Dessa data tyder på att BC-progression är kopplad till antitumörimmuneffektiviteten hos NK-celler, T-celler och B-celler. Hur BC-progression påverkar fenotypen av perifera NK-celler är dock inte rikligt undersökt.

Aktiviteten hos NK-celler bestäms av aktiverande och hämmande receptorer som finns på NK-celler som utlöses under igenkänning av målceller (häri, tumörceller), vilket inducerar en positiv respektive en negativ cellsignaleringsväg. Integrationen av dessa motsatta signaler bestämmer NK-cellaktiveringsvikten (10). Nyligen genomförda studier har visat att flera molekyler, särskilt hämmande faktorer, som ofta finns i tumörmikromiljön (TME) kan kraftigt försämra NK-cellers fenotyp och funktioner (11,12) vilket resulterar i ett minskat uttryck av aktiverande NK-cellsreceptorer och ett ökat uttryck av de hämmande receptorerna (som LAIR-1 som tidigare upptäckts i HCC kliniska blodprover T-cytotoxiska celler (13). Dessa kan främja BC-progression och skulle korrelera med den minskade cytotoxiska immuncellsfunktionen som NK-celler och T-celler eller B-celler möter (14).

1.2. Mål och mål. För att utforska CNOT7-rollen relaterad till immuncellers resistens vid BC-metastaser, försökte utredarna mäta serumnivåerna av CNOT7 i egyptiska kvinnliga BC-patienters kohort i relation till de klinisk-patologiska parametrarna. CNOT7-vävnadsuttryck i BC-vävnadsprover kategoriserade som metastaserande vs icke-metastaserande tumör tillsammans med intilliggande icke-tumörvävnadsmarginal mättes. Vidare kvantifierade den hämmande receptorn på NK-celler nämligen; LAIR-1-serumnivåer, vars överuttryck skulle vara kopplat till de aggressiva BC-egenskaperna och negativa kliniska utfall (22) som manifesterades som TNM. Korrelationen av CNOT7 med LAIR-1 blodnivåer som ska bedömas kliniskt och bekräftas eller rullas ut via bioinformatikdatabasersökning och i silicoanalys. Enligt utredarna letar efter BC-metastasmekanism, inte bara att utforska CNOT7- eller LAIR1-blodnivåer, och därför hitta fler terapeutiska alternativ, via CNOT7 molekylär dockning eller genom att blockera dess nedströmsvägar eller effektor-gen-gen-nätverksinteraktion, antingen som potentiellt lovande behandlingsalternativ. Var kommer dessa vägar och interaktioner att hämtas från KEGG-sökvägar, vidare adresserade genom textminerade interaktioner eller sökning i curated in silico bioinformatics DBs.

2.1. Studiedeltagare 2.1.1. Etiskt godkännande och informerat samtycke att delta. Etiskt godkännande erhölls från Ain Shams University, Farmaceutiska fakultetens granskningsnämnd Research Ethical Committee (REC ID# 48, 20 oktober 2021).

2.1.2. Studien genomfördes enligt riktlinjer av World Medical Association (WMA) som uppfyller Helsingforsdeklarationens etiska principer för medicinsk forskning som involverar mänskliga försökspersoner, den reviderade versionen från juli 2018, där alla deltagande individer undertecknade det etiskt godkända informerade samtycket (IC).

2.1.3. BC Patientgrupper. 90 kvinnliga BC-patienter, frivilliga i studien, diagnostiserade med antingen primärt naiva (icke-metastaserande) invasiv BC (46 patienter) eller metastaserande BC (44 patienter). Patienter registrerades slumpmässigt från den kliniska onkologiska avdelningen, fakulteten för medicin, Mansoura University Hospitals, Mansoura University, Mansoura, Egypten, efter att ha undertecknat IC.

2.1.4. BC-diagnostik utfördes med mammografi och magnetisk resonanstomografi (MRT). Fullständig historia samlades in och registrerades för alla studiedeltagare (n = 90).

Blodprover och vävnadsparaffinblocken samlades in för dem som uppfyllde inklusionskriterierna och undertecknade IC.

2.1.5. Patienternas kliniska och patologiska egenskaper. För alla BC-deltagare registrerades fullständig familjesjukdom/cancerhistoria, såväl som patienters diabetesstatus (ja mot nej), antal graviditeter (antingen färre eller fler än 2), klimakteriets status (före vs post-) och behandling(er) mottagen (neoadjuvant kemoterapi, adjuvant kemoterapi, endokrin terapi eller mastektomi). Patienternas individuella aktuella cancerstatus och den kliniska bedömningen av tumören, gjord vid Medicinska fakulteten, Mansoura University Hospital, Mansoura University, med användning av tumör-nod-metastaser (TNM) kategoriseringen enligt den 8:e upplagan av American Joint Committee on Cancer ( AJCC) iscensättningsmanual och Bloom-Richardson-skalan för histologisk gradering (24) insamlade från patienternas datafiler, efter att en biopsi togs vid tidpunkten för BC kirurgisk utforskning/undersökning.

Immunhistokemi (IHC) resultat för proliferationsindex Ki-67 (är antingen lågt eller högt), östrogenreceptor (ER), progesteronreceptor (PR) status och human epidermal tillväxtreceptor 2 (HER2/neu) (vardera antingen positiv eller negativt), body mass index (BMI) kg/m2 (normal, överviktig och fetma 18,5-24,9, 25-29,9 respektive ≥30 kg/m2) (25), lymfkörtelstatus (ingen N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) och ålder i år samlades alla in från patientjournaler och tabellerade för statistisk analys.

Molekylär BC-subtyp (27) om luminalliknande (ER+ och/eller PR+), HER-2-överuttryck (ER-, PR-, HER-2+) eller trippelnegativ BC (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) och histologiska BC-subtyper (28) om invasivt duktalt karcinom (IDC) eller inte, alla registrerades för korrelationsanalys.

3. Metoder 3.1. Biokemisk analys 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 bedömdes med användning av Human CCR4 NOT transkriptionskomplex subenhet 7 (CNOT7) ELISA Kit, Mybiosource, USA, enligt tillverkarens instruktioner. I korthet inkuberades standarderna och serumproverna av både icke-metastaserande BC- och metastaserande BC-grupper tillsammans med CNOT7-HRP-konjugat i en anti-CNOT7-antikropp förbelagd ELISA-platta från tillverkaren under en timme vid 37°C. Efter inkubationsperioden dekanterades brunnarna och tvättades fem gånger manuellt med användning av en förutspädd tvättbuffert tillhandahållen av tillverkaren. Brunnar inkuberade med ett substrat för HRP-enzym under en timme vid 37°C. Slutligen tillsattes en stopplösning för att stoppa reaktionen. Den producerade färgintensiteten mättes spektrofotometriskt vid 450 nm i en mikroplattläsare. En standardkurva plottades som relaterade färgintensiteten (optisk densitet (O.D.)) till koncentrationen av standarder. CNOT7-koncentrationen i varje prov interpolerades från denna standardkurva (kompletterande fil).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 bedömdes med användning av Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, USA. Standarder och prover pipetterades in i brunnarna på en ELISA-platta förbelagd med en LAIR-1-specifik antikropp från tillverkaren. Plattan täcktes sedan och inkuberades vid 37°C under 45 min. följt av ett manuellt tvättsteg 5 gånger med tvättbuffert som tidigare spädts ut. En HRP-konjugerad detektionsantikropp sattes till plattan och den inkuberades igen vid samma temperatur under 30 min. Efteråt tvättades plattan såsom förklarats tidigare och inkuberades med kromogenlösningar under 15 min. följt av ett sista steg med tillsats av stopplösning. Färgintensiteten mättes spektrofotometriskt vid 450 nm i en mikroplattläsare. En standardkurva plottas som relaterar färgens intensitet (O.D.) till koncentrationen av standarder. LAIR-1-koncentrationen i varje prov interpolerades från denna standardkurva (kompletterande fil). Standarder framställdes från en stamlösning och ett standardutspädningsmedel från tillverkaren som producerade en 2-faldig spädningsserie 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Seruminsulinanalys utfördes med användning av Hyperion Inc., Miami, FL, USA ELISA-kit. Testprovets färgintensitet är direkt omvänt relaterad till dess insulinkoncentration. Den normala insulinnivån för vuxna är 0-25 mU/L.

3.1.2. Immunhistokemi 3.1.2.1. CNOT7 IHC-färgningsprotokoll Användning av paraffinsnitt monterade på positivt laddade objektglas med avidin-biotin-peroxidaskomplex (ABC)-teknik (29). Sektioner från varje grupp behandlades med CNOT7 (M01) (ABNOVA, Cat # H00029883-M01, Monoclonal antibody, Clone 2F6) vid 1:25 utspädning innan de exponerades för de kemikalier som är nödvändiga för ABC-metoden (Vectastain ABC-HRP kit, Vector laboratorier). För att detektera antigen-antikroppskomplex märktes marköruttryck med peroxidas och färgades med diaminobensidin (DAB, tillverkad av Sigma). Negativa kontroller inkluderades med användning av icke-immunserum i stället för de primära eller sekundära antikropparna. Leica-mikroskop (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Schweiz) användes för att utvärdera IHC-färgade sektioner (Leica Microsystems, Schweiz).

3.1.2.2. Kvantitativ utvärdering av CNOT7 IHC-resultat "Area %" I varje seriell sektion av de analyserade patientgrupperna valdes sex högeffektfält (x 400) med positiv brun immunfärgning för undersökning. Arean% av CNOT7-färgade sektioner beräknades med hjälp av Leica QWin 500 bildanalysatorsystem (UK). Denna bildanalysator innehöll ett Leica-mikroskop, en färgad videokamera, en färgad monitor och en hårddisk från en Leica IBM-persondator kopplad till mikroskopet och hanterad av Leica QWin 500-programvaran.

Area %-data rapporterades statistiskt i termer av medelvärde och standardfel för medelvärde (medelvärde ± S.E.M) för åtta bilder från fyra icke-metastaserande prover och fyra metastatiska prover.

3.2. In silico Bioinformatikanalys 3.2.1. Bröstcancer Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Uppdaterad den 28 juni 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) för att utforska sambandet mellan CNOT7 och LAIR1.

3.2.2. Funktionsmodul för LinkedOmics används för att utföra analys av Gene Ontology biologiska process (GO_BP) med genuppsättningsanrikningsanalys (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Gen-gen-interaktioner och vägar från in silico-kurerade databaser och text-mining Via Genome Browser för målgener med hjälp av University of California Santa Cruiz (UCSC) (32) Genomics institute http://genome.ucsc.edu/index.html LAIR1 och CNOT7 gener interaktioner hämtades, med att nämna kända hämmare läkemedel från DrugBank.

3.2.4. Protein-Protein Interaction (PPI) från databasen Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) version 11.5 https://string-db.org/ som förutsäger interaktioner baserat på relevanta experimentella data, sekvenseringsresultat och litteratur från >1100 fullständigt sekvenserad organism (33). Åtkom den 20 januari 2023 för att utforska LAIR-1-interagerande proteiner.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Utforska genuttrycksmönster över normala vävnader och tumörvävnader (GENT2) med överlevnad http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Molekylär dockning: 3.3.1. Beredning av proteinstrukturerna för LAIR-1 och CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Från proteindatabanken (PDB) https:// www.rcsb.org/search kristallstrukturen för Human LAIR-1 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Efter att ha laddat strukturerna i molekylär driftsmiljö (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Integrerad datorstödd plattform för molekylär design, de förbereddes med hjälp av standardparametrarna i "QuickPrep Panel", inklusive avlägsnande av vattenmolekyler, tillsats av väteatomer till proteinstrukturen, justering av protonationstillstånd och säkerställande av energiminimering av proteinstrukturerna med Amber10 :EHT kraftfält.

Eftersom dessa kristallstrukturer inte samkristalliserades med några ligander, MOE SiteFinder, användes ett program för bindningsplatsanalys utrustat i MOE för att förutsäga de möjliga bindningsställena. Dessa fickor rangordnas baserat på deras benägenhet för ligandbindning (PLB). CNOT7 är en receptor utan tillgänglig PDB-samkristalliserad struktur, därför använde utredarna MOE siteFinder-verktyget för att hjälpa till i vår studie, med guiden från tidigare litteratur som rapporterade flera essentiella aminosyrarester involverade i ligand-CNOT7-proteininteraktioner som Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) har identifierats som relativt signifikanta.

3.3.2. Liganderdatauppsättning "builder-programmet" implementerat i MOE användes för att modellera sex ligander i studien; Vitamin E, Colchicin, Prodigiosin, Riboflavin, Telmisartan och Pioglitazon, där alla möjliga konformationer vid det fysiologiska pH-värdet erhölls.

3.3.3. Dockningssimuleringar Dockning av de erhållna konformationerna av de sex liganderna utfördes med användning av placerings- och förfiningsalgoritmer från MOE-programmet. Initial dockning av molekylerna i de aktiva platserna använde placeringsmetoden 'Triangle Matcher' och 'London dG'-poängfunktionen. Ytterligare efterplaceringsförfining av dockningspositioner uppnåddes genom att använda 'GBVI/WSA dG'-poängmetoden. Poserna med minimal energi användes för visualisering av bindningsinteraktionerna såväl som ockupation av receptorernas bindningsställe.

3.4. Statistisk analys 3.4.1. Data som samlades in registrerades och analyserades med hjälp av programvaran Statistical Package for Social Science (SPSS, version 17, Chicago, IL, USA).

3.4.2. Kvalitativa data presenterades som frekvenser (n) och procentsatser (%). 3.4.3. Test för kvantitativ datanormalitet utfördes med användning av Shapiro-Wilk-kalkylatorn. Normalt fördelade variabler representerades som medelvärde ± S.E.M och analyserades med två prover oberoende Students t-test för jämförelse av två grupper. Ej normalfördelade data presenterades som median (interkvartilintervall som första till tredje kvartil eller 25:e-75:e kvartilen) och analyserades med Mann-Whitney (U) test.

3.4.4. ROC-kurva utfördes för att detektera de bästa gränspunkterna för att kategorisera CNOT7- och LAIR-1-serumnivåer i undergrupper med låga och höga uttryck.

3.4.5. Chi-square-testet användes för att utvärdera sambandet mellan CNOT7-serumnivåer och klinisk-patologiska parametrar. Pearsons korrelationstest användes för att bedöma sambandet mellan parametriska variabler. Punkt-biseriell korrelation användes för att bestämma korrelationen mellan parametrar när en av dem var en dikotom variabel.

3.4.6. Signifikansnivån sattes till P<0,05 och konfidensnivån (C.I) eller intervallet till 95 % respektive 5 %.