A CCR4-NOT Complex 7. alegység kifejeződésének hatása a természetes ölősejtek rezisztenciájára áttétes emlőrákban (CCR4-NOT)

1. Bevezetés 1.1. Kutatási probléma. A mellrák (BC) a nők daganatos halálozásának elsődleges oka (1, 2). Ennek a mortalitásnak a fő oka a metasztázisok más szervekre való átterjedése (3). A metasztázis akkor következik be, amikor a tumorsejtek invazív tulajdonságokat (4) és képesek kiszabadulni a daganatellenes immunitásból; a tumorkontroll szempontjából fontos veleszületett és adaptív immunválaszok (5,6). Jelentések szerint a perifériás vér természetes gyilkos (NK) sejtek érésének és citotoxikus funkcióinak jelentős károsodása kísérte a BC progresszióját (7). Számos génexpressziós profilozó vizsgálat kimutatta, hogy a jobb eredmény az NK-sejteket tartalmazó erős citotoxikus infiltrátummal jár (8,9). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a BC progressziója összefügg az NK-sejtek, T-sejtek és B-sejtek daganatellenes immunhatékonyságával. Azonban nem vizsgálták alaposan, hogy a BC progressziója hogyan befolyásolja a perifériás NK-sejtek fenotípusát.

Az NK-sejtek aktivitását az NK-sejteken jelenlévő aktiváló és gátló receptorok határozzák meg, amelyek a célsejt (itt tumorsejt) felismerése során aktiválódnak, pozitív, illetve negatív sejtjelátviteli útvonalat indukálva. Ezen ellentétes jelek integrálása határozza meg az NK-sejt aktiválási súlyát (10). A közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy számos molekula, különösen a gátló faktorok, amelyek gyakran megtalálhatók a tumor mikrokörnyezetében (TME), élesen ronthatják az NK-sejtek fenotípusát és funkcióit (11, 12), ami az aktiváló NK-sejt-receptorok expressziójának csökkenését és az NK-sejtek fokozott expresszióját eredményezheti. a gátló receptorok (mint például a LAIR-1, amelyet korábban HCC klinikai vérmintákban kimutattak, T-citotoxikus sejtekben (13). Ezek elősegíthetik a BC progresszióját, és korrelálnak az immunsejtek citotoxikus funkciójával, amellyel az NK-sejtek és a T-sejtek vagy a B-sejtek találkoznak (14).

1.2. Cél és célkitűzések. A BC metasztázisban az immunsejtek rezisztenciájával kapcsolatos CNOT7 szerep feltárása érdekében a kutatók megkísérelték megmérni a CNOT7 szérumszintjét egyiptomi női BC betegek kohorszában a klinikopatológiai paraméterekkel összefüggésben. Mértük a CNOT7 szöveti expresszióját a metasztatikus vagy nem metasztatikus tumorként kategorizált BC szövetmintákban, a szomszédos, nem tumoros szövetszegéllyel együtt. Továbbá számszerűsítettük az NK-sejtek gátló receptorát, nevezetesen; LAIR-1 szérumszintek, amelyek túlzott expressziója az agresszív BC-jellemzőkkel és a TNM-ben megnyilvánuló kedvezőtlen klinikai kimenetel(ek)hez (22) kapcsolódik. A CNOT7 korrelációját a LAIR-1 vérszinttel klinikailag értékelni kell, és meg kell erősíteni vagy ki kell terjeszteni bioinformatikai adatbázisok keresésével és in silico elemzésével. A kutatók a BC metasztázis mechanizmusát keresik, nem csak a CNOT7 vagy LAIR1 vérszintek feltárását, ezért további terápiás lehetőségeket találnak a CNOT7 molekuláris dokkoláson keresztül, vagy a downstream útvonalak vagy az effektor gén-gén hálózatok kölcsönhatásának blokkolásával, akár potenciálisan ígéretesnek. kezelési lehetőségek. Ahol ezek az útvonalak és interakciók lekérhetők a KEGG útvonalak kereséséből, tovább foglalkoznak a szövegbányászott interakciókkal vagy a kurált in silico bioinformatikai adatbázisokban.

2.1. A vizsgálatban résztvevők 2.1.1. Etikai jóváhagyás és tájékozott hozzájárulás a részvételhez. Az etikai jóváhagyást az Ain Shams Egyetem Gyógyszerészeti Karának felülvizsgálati bizottsága Kutatási Etikai Bizottsága (REC ID# 48, 2021. október 20.) szerezte be.

2.1.2. A vizsgálatot az Orvosi Világszövetség (WMA) iránymutatásai szerint végezték el, teljesítve a Helsinki Nyilatkozat emberi alanyok bevonásával végzett orvosi kutatások etikai alapelveit, a 2018. júliusi felülvizsgált változatot, amelyben minden résztvevő aláírta az etikailag jóváhagyott informált beleegyezést (IC).

2.1.3. BC Betegcsoportok. 90 női BC-beteg, akik önkéntesen vettek részt a vizsgálatban, vagy elsődleges naiv (nem metasztatikus) invazív BC-vel (46 beteg), vagy metasztatikus BC-vel (44 beteg) diagnosztizáltak. A betegeket véletlenszerűen vették fel a Mansoura University Hospitals Orvostudományi Kar Klinikai Onkológiai Osztályáról, Mansoura University, Mansoura, Egyiptom, miután aláírták az IC-t.

2.1.4. A BC diagnózisát mammográfiával és mágneses rezonancia képalkotással (MRI) végezték. A teljes anamnézist összegyűjtöttük és rögzítettük minden vizsgálati résztvevő esetében (n = 90).

Vérmintákat és szöveti paraffin blokkokat gyűjtöttünk azoktól, akik megfeleltek a felvételi kritériumoknak és aláírták az IC-t.

2.1.5. A betegek klinikai és patológiás jellemzői. Minden BC résztvevőnél feljegyezték a teljes családi betegséget/rákos anamnézist, valamint a betegek diabéteszes állapotát (igen vs nem), a terhességek számát (kettőnél kevesebb vagy több), a menopauza állapotát (pre- és post-) és kapott kezelés(ek) (neoadjuváns kemoterápia, adjuváns kemoterápia, endokrin terápia vagy mastectomia). A betegek egyéni aktuális rákos állapota és a tumor klinikai értékelése a Mansourai Egyetem Orvostudományi Karán, a Mansourai Egyetemi Kórházon, az Amerikai Rákellenes Vegyes Bizottság 8. kiadása szerinti tumor-csomó-metasztázis (TNM) kategorizáció alkalmazásával. AJCC) stádiumbeosztási kézikönyv és a Bloom-Richardson Skála a szövettani osztályozáshoz (24), amelyet a betegek adatállományaiból gyűjtöttek össze, miután a BC sebészeti feltárása/vizsgálata során biopsziát vettek.

Az immunhisztokémiai (IHC) eredmények a Ki-67 proliferációs indexre (alacsony vagy magas), az ösztrogénreceptorra (ER), a progeszteronreceptorra (PR) és a humán epidermális növekedési receptor 2-re (HER2/neu) (mindegyik pozitív vagy negatív), testtömeg-index (BMI) kg/m2 (normál, túlsúlyos és elhízott 18,5-24,9, 25-29,9, illetve ≥30 kg/m2) (25), nyirokcsomó (LN) állapot (nincs N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) és életkor években. a betegek aktáiból és táblázatba foglalva statisztikai elemzés céljából.

Molekuláris BC altípus (27), ha luminális (ER+ és/vagy PR+), HER-2 overexpresszió (ER-, PR-, HER-2+) vagy tripla negatív BC (TNBC) (ER-, PR-, HER) -2-) és a szövettani BC altípusokat (28), függetlenül attól, hogy volt-e invazív ductalis karcinóma (IDC) vagy sem, mind feljegyeztük a korrelációs elemzéshez.

3. Módszerek 3.1. Biokémiai elemzés 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA A CNOT7-et a Human CCR4 NOT transzkripciós komplex 7-es alegysége (CNOT7) ELISA Kit (Mybiosource, USA) segítségével értékelték ki a gyártó utasításait követve. Röviden, mind a nem áttétes BC, mind a metasztatikus BC csoport standardjait és szérummintáit CNOT7-HRP konjugátummal együtt inkubáltuk a gyártó által szállított, anti-CNOT7 antitesttel bevont ELISA lemezen egy órán keresztül 37 °C-on. Az inkubációs periódus után a lyukakat dekantáltuk és ötször mostuk manuálisan a gyártó által biztosított előhígított mosópufferrel. A lyukakat a HRP enzim szubsztrátjával inkubáltuk egy órán át 37 °C-on. Végül leállító oldatot adtunk a reakció leállítására. A képződött színintenzitást spektrofotometriásan mértük 450 nm-en mikrolemez-leolvasóban. Egy standard görbét ábrázoltunk, amely a színintenzitást (Optikai sűrűség (O.D.)) a standardok koncentrációjához viszonyította. A CNOT7 koncentrációját minden mintában ebből a standard görbéből interpoláltuk (kiegészítő fájl).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA A LAIR-1-et Human LAIR-1 ELISA Kit (Mybiosource, USA) segítségével értékeltük. A standardokat és a mintákat a gyártó által szállított LAIR-1 specifikus antitesttel előzetesen bevont ELISA lemez lyukaiba pipettáztuk. A lemezt ezután lefedtük, és 37 °C-on 45 percig inkubáltuk. ezt követi egy ötszörös kézi mosási lépés, előzőleg hígított mosópufferrel. HRP-konjugált detektáló antitestet adtunk a lemezhez, és ismét ugyanazon a hőmérsékleten inkubáltuk 30 percig. Ezt követően a lemezt a korábban leírtak szerint mostuk, és 15 percig kromogén oldatokkal inkubáltuk. ezt követi a stopoldat hozzáadásának utolsó lépése. A szín intenzitását spektrofotometriásan mértük 450 nm-en mikrolemez-leolvasóban. Egy standard görbét ábrázolunk, amely a szín intenzitását (O.D.) viszonyítja a standardok koncentrációjához. A LAIR-1 koncentrációját minden mintában ebből a standard görbéből interpoláltuk (kiegészítő fájl). A standardokat törzsoldatból és a gyártó által biztosított standard hígítóból készítettük el, amely kétszeres hígítási sorozatot állított elő. 3.1.1.3. s. Insulin ELISA A szérum inzulin vizsgálatot Hyperion Inc., Miami, FL, USA ELISA kit segítségével végeztük. A vizsgálati minta színintenzitása közvetlenül fordítottan arányos az inzulinkoncentrációjával. A normál felnőtt inzulinszint 0-25 mU/L.

3.1.2. Immunhisztokémia 3.1.2.1. CNOT7 IHC festési protokoll Pozitív töltésű tárgylemezekre szerelt paraffin metszetek avidin-biotin-peroxidáz komplex (ABC) technikával (29). Az egyes csoportok metszeteit CNOT7-tel (M01) kezeltük (ABNOVA, katalógusszám H00029883-M01, monoklonális antitest, 2F6 klón) 1:25 hígításban, mielőtt az ABC-módszerhez szükséges vegyszerekkel érintkeztek (Vectastain ABC-HRP kit, Vector). laboratóriumok). Az antigén-antitest komplexek kimutatására a marker expresszióját peroxidázzal jelöltük, és diaminobenzidinnel (DAB, Sigma) színeztük. A negatív kontrollokat nem-immun szérum alkalmazásával az elsődleges vagy másodlagos antitestek helyett alkalmaztuk. Leica mikroszkópot (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Svájc) használtunk az IHC-vel festett metszetek értékelésére (Leica Microsystems, Svájc).

3.1.2.2. A CNOT7 IHC eredmények kvantitatív értékelése "Terület %" Az elemzett betegcsoportok minden sorozatában hat nagy teljesítményű mezőt (x 400) választottunk ki vizsgálatra pozitív barna immunfestéssel. A CNOT7-el festett metszetek terület%-át a Leica QWin 500 képelemző számítógépes rendszer (UK) segítségével számítottuk ki. Ez a képelemző egy Leica mikroszkópot, egy színes videokamerát, egy színes monitort és egy Leica IBM személyi számítógép merevlemezét foglalta magában, amely a mikroszkóphoz volt kapcsolva, és amelyet Leica QWin 500 szoftver kezel.

A terület%-os adatokat statisztikailag az átlag és az átlag standard hibája (átlag ± S.E.M) formájában jelentették négy nem áttétet képező mintából és négy metasztatikus mintából származó nyolc kép esetében.

3.2. In silico Bioinformatikai elemzés 3.2.1. Mellrák Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Frissítve 2023. június 28-án.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30), hogy feltárja a CNOT7 és a LAIR1 közötti összefüggést.

3.2.2. A LinkedOmics funkciómodulja a génontológia biológiai folyamatának (GO_BP) elemzéséhez génkészlet-dúsítási elemzéssel (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Gén-gén kölcsönhatások és útvonalak in silico kurált adatbázisokból és szövegbányászatból Genome Browser segítségével a célgénekhez a University of California Santa Cruiz (UCSC) segítségével (32) Genomics Institute http://genome.ucsc.edu/index.html A LAIR1 és CNOT7 gének kölcsönhatásait lekértük, a DrugBank ismert inhibitor gyógyszere(ke)t említve.

3.2.4. Protein-Protein Interaction (PPI) a Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) adatbázis 11.5-ös verziójából https://string-db.org/, amely a releváns kísérleti adatok, szekvenálási eredmények és szakirodalom alapján jósolja meg az interakciókat. >1100 teljesen szekvenált organizmus (33). Hozzáférés dátuma: 2023. január 20., a LAIR-1-gyel kölcsönhatásba lépő fehérjék felfedezéséhez.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Génexpressziós minták feltárása normál és tumorszövetekben (GENT2) a túlélés segítségével http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Molekuláris dokkolás: 3.3.1. A LAIR-1 és a CNOT7 fehérjeszerkezetének elkészítése https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 A protein adatbankból (PDB) https:// www.rcsb.org/search a Human LAIR-1 kristályszerkezete (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 A struktúrák betöltése után molekuláris működési környezetben (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Integrált számítógéppel segített molekuláris tervezési platform, a 'QuickPrep Panel' alapértelmezett paramétereivel készültek, beleértve a vízmolekulák eltávolítását, hidrogénatomok hozzáadását a fehérje szerkezetéhez, a protonálódási állapotok beállítását és a fehérjeszerkezetek energiaminimalizálásának biztosítását az Amber10 segítségével. :EHT erőtér.

Mivel ezek a kristályszerkezetek egyetlen ligandummal sem kristályosodtak együtt, a MOE SiteFinder programot, a MOE-ben felszerelt kötőhely-elemző programot használtuk a lehetséges kötőhelyek előrejelzésére. Ezeket a zsebeket ligandkötési hajlamuk (PLB) alapján rangsorolják. A CNOT7 egy olyan receptor, amelynek nem áll rendelkezésre PDB kokristályos szerkezete, ezért a kutatók a MOE siteFinder eszközt használták tanulmányunk segítségére, a korábbi irodalmak útmutatója alapján, amelyek számos esszenciális aminosavról számolnak be, amelyek részt vesznek a ligand-CNOT7 fehérje kölcsönhatásokban, mint például a Glu247, A Tyr260, Glu278 (34,35) viszonylag szignifikánsnak bizonyult.

3.3.2. Ligandum adatkészletek kezelése A MOE-ben megvalósított „builder programot” hat ligandum modellezésére használtuk a tanulmányban; E-vitamin, kolhicin, prodigiosin, riboflavin, telmizartán és pioglitazon, ahol az összes lehetséges konformációt megkaptuk a fiziológiás pH-n.

3.3.3. Dokkolási szimulációk A hat ligandum kapott konformációinak dokkolása MOE program elhelyezési és finomító algoritmusaival történt. A molekulák kezdeti dokkolása az aktív helyeken a „Triangle Matcher” elhelyezési módszert és a „London dG” pontozási funkciót használta. A dokkolási pózok elhelyezése utáni további finomítása a „GBVI/WSA dG” pontozási módszerrel történt. A minimális energiájú pózokat használtuk a kötési kölcsönhatások megjelenítésére, valamint a receptorok kötőhelyének elfoglalására.

3.4. Statisztikai elemzés 3.4.1. Az összegyűjtött adatokat a Statistical Package for Social Science szoftver (SPSS, Version 17, Chicago, IL, USA) segítségével rögzítettük és elemeztük.

3.4.2. A kvalitatív adatokat gyakoriság (n) és százalék (%) formájában mutattuk be. 3.4.3. A kvantitatív adatnormalitás vizsgálatát a Shapiro-Wilk számológép segítségével végeztük. A normál eloszlású változókat átlag ± S.E.M-ként ábrázoltuk, és két mintától független Students-t-teszttel elemeztük a két csoport összehasonlítására. A nem normális eloszlású adatokat mediánként (az interkvartilis tartományok első és harmadik kvartilisként vagy 25-75. kvartilisként) mutatták be, és a Mann-Whitney (U) teszttel elemezték.

3.4.4. A ROC görbét a legjobb határpontok kimutatására végeztük, hogy a CNOT7 és LAIR-1 szérumszinteket alacsony és magas expressziós alcsoportokba soroljuk.

3.4.5. A Khi-négyzet tesztet használtuk a CNOT7 szérumszintek és a klinikopatológiai paraméterek közötti összefüggés értékelésére. Pearson korrelációs tesztet alkalmaztunk a paraméteres változók közötti összefüggés felmérésére. Pont-biszerial korrelációkat használtunk a paraméterek közötti korreláció meghatározására, ha az egyik dichotóm változó volt.

3.4.6. A szignifikancia szintet P<0,05-re, a konfidenciaszintet (C.I) vagy az intervallumot 95%-ra, illetve 5%-ra állítottuk be.