Einfluss der Expression der CCR4-NOT-Komplex-Untereinheit 7 auf die Resistenz natürlicher Killerzellen bei metastasiertem Brustkrebs (CCR4-NOT)

1. Einleitung 1.1. Forschungsproblem. Brustkrebs (BC) ist die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle bei Frauen (1,2). Die Hauptursache dieser Mortalität ist die Ausbreitung von Metastasen auf andere Organe (3). Metastasierung tritt auf, wenn Tumorzellen invasive Eigenschaften (4) und die Fähigkeit erlangen, der Antitumorimmunität zu entkommen; angeborene und adaptive Immunantworten, die für die Tumorkontrolle wichtig sind (5,6). Es wurde berichtet, dass mit der BC-Progression eine erhebliche Beeinträchtigung der Reifung natürlicher Killerzellen (NK) im peripheren Blut und der zytotoxischen Funktionen einhergeht (7). Mehrere Genexpressionsprofilierungsstudien haben gezeigt, dass ein besseres Ergebnis mit einem starken zytotoxischen Infiltrat mit NK-Zellen verbunden ist (8,9). Diese Daten legen nahe, dass die BC-Progression mit der Antitumor-Immuneffizienz von NK-Zellen, T-Zellen und B-Zellen zusammenhängt. Wie sich die BC-Progression auf den Phänotyp peripherer NK-Zellen auswirkt, ist jedoch nicht ausführlich untersucht.

Die Aktivität von NK-Zellen wird durch aktivierende und hemmende Rezeptoren auf NK-Zellen bestimmt, die während der Erkennung von Zielzellen (hier Tumorzellen) ausgelöst werden und einen positiven bzw. negativen Zellsignalweg induzieren. Die Integration dieser gegensätzlichen Signale bestimmt das Aktivierungsgewicht der NK-Zellen (10). Jüngste Studien haben gezeigt, dass mehrere Moleküle, insbesondere Hemmfaktoren, die häufig in der Tumormikroumgebung (TME) vorkommen, den Phänotyp und die Funktionen von NK-Zellen stark beeinträchtigen können (11,12), was zu einer verminderten Expression aktivierender NK-Zellrezeptoren und einer erhöhten Expression von führt die inhibitorischen Rezeptoren (wie LAIR-1, das zuvor in klinischen HCC-Blutproben nachgewiesen wurde) T-zytotoxische Zellen (13). Diese können die BC-Progression fördern und würden mit der verminderten zytotoxischen Funktion der Immunzellen korrelieren, die bei NK-Zellen und T-Zellen oder B-Zellen auftritt (14).

1.2. Ziel und Ziele. Um die Rolle von CNOT7 im Zusammenhang mit der Resistenz von Immunzellen bei der BC-Metastasierung zu untersuchen, versuchten die Forscher, die Serumspiegel von CNOT7 in der Kohorte ägyptischer weiblicher BC-Patienten in Bezug auf die klinisch-pathologischen Parameter zu messen. Die CNOT7-Gewebeexpression in BC-Gewebeproben, die als metastasierter bzw. nicht-metastasierter Tumor kategorisiert wurden, wurde zusammen mit dem angrenzenden Nicht-Tumor-Geweberand gemessen. Darüber hinaus wurde der inhibitorische Rezeptor auf NK-Zellen quantifiziert, nämlich; LAIR-1-Serumspiegel, deren Überexpression mit den aggressiven BC-Merkmalen und nachteiligen klinischen Ergebnissen (22) verbunden wäre, die sich als TNM manifestierten. Die Korrelation von CNOT7 mit den LAIR-1-Blutspiegeln muss klinisch beurteilt und durch Suche in Bioinformatik-Datenbanken und In-silico-Analyse bestätigt oder eingeführt werden. Den Forschern zufolge suchen die Forscher nach dem BC-Metastasierungsmechanismus und nicht nur nach der Untersuchung der CNOT7- oder LAIR1-Blutspiegel. Daher suchen sie nach weiteren therapeutischen Optionen, etwa durch molekulares Andocken von CNOT7 oder durch die Blockierung seiner nachgeschalteten Signalwege oder die Interaktion zwischen Effektorgen und Gennetzwerken, was beides als potenziell vielversprechend gilt Behandlungsmöglichkeiten. Diese Pfade und Interaktionen werden aus der KEGG-Pfadsuche abgerufen und durch Text-Mining-Interaktionen oder durch die Suche in kuratierten in silico-Bioinformatik-DBs weiter untersucht.

2.1. Studienteilnehmer 2.1.1. Ethische Genehmigung und Einverständniserklärung zur Teilnahme. Die ethische Genehmigung wurde von der Forschungsethikkommission der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams University eingeholt (REC ID# 48, 20. Oktober 2021).

2.1.2. Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der World Medical Association (WMA) durchgeführt und erfüllt die ethischen Grundsätze der Deklaration von Helsinki für medizinische Forschung mit menschlichen Probanden, der überarbeiteten Fassung vom Juli 2018, in der alle teilnehmenden Personen die ethisch genehmigte Einverständniserklärung (IC) unterzeichnet haben.

2.1.3. BC-Patientengruppen. Bei 90 weiblichen BC-Patienten, die freiwillig an der Studie teilnahmen, wurde entweder primär naiver (nicht metastasierter) invasiver BC (46 Patienten) oder metastasierter BC (44 Patienten) diagnostiziert. Die Patienten wurden nach der Unterzeichnung des IC nach dem Zufallsprinzip aus der Abteilung für klinische Onkologie der medizinischen Fakultät der Mansoura University Hospitals der Mansoura University, Mansoura, Ägypten, rekrutiert.

2.1.4. Die BC-Diagnose erfolgte mittels Mammographie und Magnetresonanztomographie (MRT). Für alle Studienteilnehmer (n = 90) wurde die vollständige Anamnese erhoben und aufgezeichnet.

Für diejenigen, die die Einschlusskriterien erfüllten und die IC unterzeichneten, wurden Blutproben und Gewebeparaffinblöcke entnommen.

2.1.5. Klinische und pathologische Merkmale der Patienten. Für alle BC-Teilnehmer wurde die vollständige familiäre Krankheits-/Krebsanamnese sowie der Diabetesstatus der Patientinnen (ja vs. nein), die Anzahl der Schwangerschaften (entweder weniger oder mehr als 2), der Wechseljahrsstatus (vor vs. post) usw. erfasst Behandlung(en) erhalten (neoadjuvante Chemotherapie, adjuvante Chemotherapie, endokrine Therapie oder Mastektomie). Der individuelle aktuelle Krebsstatus der Patienten und die klinische Beurteilung des Tumors, durchgeführt an der medizinischen Fakultät des Mansoura University Hospital, Mansoura University, unter Verwendung der Tumor-Knoten-Metastasen-Kategorisierung (TNM) gemäß der 8. Auflage des American Joint Committee on Cancer ( AJCC)-Staging-Handbuch und die Bloom-Richardson-Skala für die histologische Einstufung (24), die aus den Patientendatendateien entnommen wurden, nachdem zum Zeitpunkt der chirurgischen Untersuchung/Untersuchung in BC eine Biopsie entnommen wurde.

Ergebnisse der Immunhistochemie (IHC) für den Proliferationsindex Ki-67 (entweder niedrig oder hoch), den Status des Östrogenrezeptors (ER), des Progesteronrezeptors (PR) und den humanen epidermalen Wachstumsrezeptor 2 (HER2/neu) (jeweils entweder positiv oder positiv). negativ), Body-Mass-Index (BMI) kg/m2 (normal, übergewichtig und fettleibig 18,5-24,9, Es wurden alle Patienten mit einem Gewicht von 25–29,9 bzw. ≥30 kg/m2 (25), dem Lymphknotenstatus (LN) (keine N0, N1–3, N4–9, ≥ 10) (26) und dem Alter in Jahren erfasst aus Patientenakten entnommen und zur statistischen Auswertung tabellarisch dargestellt.

Molekularer BC-Subtyp (27), wenn luminaler Typ (ER+ und/oder PR+), HER-2-Überexpression (ER-, PR-, HER-2+) oder dreifach negativer BC (TNBC) (ER-, PR-, HER). -2-) und histologische BC-Subtypen (28), ob invasives Duktalkarzinom (IDC) oder nicht, wurden alle für die Korrelationsanalyse erfasst.

3. Methoden 3.1. Biochemische Analyse 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 wurde mit dem Human CCR4 NOT Transcription Complex Subunit 7 (CNOT7) ELISA Kit, Mybiosource, USA, gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Kurz gesagt, die Standards und Serumproben sowohl der nicht-metastasierten BC-Gruppe als auch der metastasierten BC-Gruppe wurden zusammen mit dem CNOT7-HRP-Konjugat in einer vom Hersteller gelieferten, mit Anti-CNOT7-Antikörpern vorbeschichteten ELISA-Platte eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Vertiefungen dekantiert und fünfmal manuell mit einem vom Hersteller bereitgestellten vorverdünnten Waschpuffer gewaschen. Die Vertiefungen wurden mit einem Substrat für das HRP-Enzym eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Abschließend wurde eine Stopplösung zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die erzeugte Farbintensität wurde spektrophotometrisch bei 450 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Es wurde eine Standardkurve erstellt, die die Farbintensität (optische Dichte (O.D.)) mit der Konzentration der Standards in Beziehung setzt. Die CNOT7-Konzentration in jeder Probe wurde aus dieser Standardkurve (Zusatzdatei) interpoliert.

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 wurde mit dem Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, USA, bewertet. Standards und Proben wurden in die Vertiefungen einer ELISA-Platte pipettiert, die mit einem vom Hersteller gelieferten LAIR-1-spezifischen Antikörper vorbeschichtet war. Anschließend wurde die Platte abgedeckt und 45 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. gefolgt von einem 5-maligen manuellen Waschschritt mit zuvor verdünntem Waschpuffer. Der Platte wurde ein HRP-konjugierter Nachweisantikörper zugesetzt und sie wurde erneut 30 Minuten lang bei der gleichen Temperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte wie zuvor erläutert gewaschen und 15 Minuten lang mit Chromogenlösungen inkubiert. gefolgt von einem letzten Schritt der Zugabe der Stopplösung. Die Farbintensität wurde spektrophotometrisch bei 450 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Es wird eine Standardkurve erstellt, die die Intensität der Farbe (O.D.) mit der Konzentration der Standards in Beziehung setzt. Die LAIR-1-Konzentration in jeder Probe wurde aus dieser Standardkurve (Zusatzdatei) interpoliert. Standards wurden aus einer Stammlösung und einem vom Hersteller bereitgestellten Standardverdünnungsmittel hergestellt, wodurch eine zweifache Verdünnungsreihe 3.1.1.3 erstellt wurde. s.Insulin ELISA Der Seruminsulintest wurde mit dem ELISA-Kit von Hyperion Inc., Miami, FL, USA durchgeführt. Die Farbintensität der Testprobe steht im direkten umgekehrten Zusammenhang mit ihrer Insulinkonzentration. Der normale Insulinspiegel für Erwachsene liegt bei 0–25 mU/L.

3.1.2. Immunhistochemie 3.1.2.1. CNOT7 IHC-Färbeprotokoll Unter Verwendung von Paraffinschnitten, die mithilfe der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)-Technik auf positiv geladene Objektträger montiert wurden (29). Schnitte aus jeder Gruppe wurden mit CNOT7 (M01) (ABNOVA, Kat.-Nr. H00029883-M01, monoklonaler Antikörper, Klon 2F6) in einer Verdünnung von 1:25 behandelt, bevor sie den für die ABC-Methode erforderlichen Chemikalien (Vectastain ABC-HRP Kit, Vector) ausgesetzt wurden Labore). Um Antigen-Antikörper-Komplexe nachzuweisen, wurde die Markerexpression mit Peroxidase markiert und mit Diaminobenzidin (DAB, hergestellt von Sigma) gefärbt. Negativkontrollen wurden unter Verwendung von nicht-immunem Serum anstelle der primären oder sekundären Antikörper einbezogen. Das Leica-Mikroskop (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Schweiz) wurde zur Auswertung von IHC-gefärbten Schnitten (Leica Microsystems, Schweiz) verwendet.

3.1.2.2. Quantitative Auswertung der CNOT7-IHC-Ergebnisse „Fläche %“ In jedem Serienschnitt der analysierten Patientengruppen wurden sechs Hochleistungsfelder (x 400) mit positiver brauner Immunfärbung zur Untersuchung ausgewählt. Der Flächenanteil der mit CNOT7 gefärbten Schnitte wurde mit dem Bildanalyse-Computersystem Leica QWin 500 (UK) berechnet. Dieser Bildanalysator umfasste ein Leica-Mikroskop, eine Farbvideokamera, einen Farbmonitor und eine Festplatte eines Leica IBM-Personalcomputers, der mit dem Mikroskop verbunden war und von der Leica QWin 500-Software verwaltet wurde.

Die Flächen-%-Daten wurden statistisch als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (Mittelwert ± S.E.M) für acht Bilder von vier nicht metastasierten Proben und vier metastatischen Proben angegeben.

3.2. In silico Bioinformatik-Analyse 3.2.1. Brustkrebs Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Aktualisiert am 28. Juni 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) zur Untersuchung der Korrelation zwischen CNOT7 und LAIR1.

3.2.2. Funktionsmodul von LinkedOmics zur Durchführung einer Analyse des biologischen Prozesses der Genontologie (GO_BP) mit Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Gen-Gen-Interaktionen und -Pfade aus in silico kuratierten DBs und Text-Mining über den Genome Browser für Zielgene unter Verwendung der University of California Santa Cruiz (UCSC) (32) Genomics Institute http://genome.ucsc.edu/index.html Es wurden Wechselwirkungen zwischen den Genen LAIR1 und CNOT7 ermittelt, wobei bekannte Hemmstoffe von DrugBank erwähnt wurden.

3.2.4. Protein-Protein-Interaktion (PPI) aus der Datenbank Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING), Version 11.5 https://string-db.org/, die Interaktionen auf der Grundlage relevanter experimenteller Daten, Sequenzierungsergebnisse und Literatur vorhersagt >1100 vollständig sequenzierte Organismen (33). Zugriff am 20. Januar 2023, um LAIR-1-interagierende Proteine ​​zu untersuchen.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Erforschung von Genexpressionsmustern in Normal- und Tumorgewebe (GENT2) mit Überleben http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Molekulares Docking: 3.3.1. Vorbereitung der Proteinstrukturen von LAIR-1 und CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Aus der Proteindatenbank (PDB) https:// www.rcsb.org/search die Kristallstruktur von Human LAIR-1 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Nach dem Laden der Strukturen in der molekularen Betriebsumgebung (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Sie wurden mit der integrierten computergestützten Plattform für molekulares Design unter Verwendung der Standardparameter im „QuickPrep Panel“ hergestellt, einschließlich der Entfernung von Wassermolekülen, der Hinzufügung von Wasserstoffatomen zur Proteinstruktur, der Anpassung von Protonierungszuständen und der Sicherstellung der Energieminimierung der Proteinstrukturen mit Amber10 :EHT-Kraftfeld.

Da diese Kristallstrukturen nicht mit Liganden kokristallisiert waren, wurde MOE SiteFinder, ein im MOE integriertes Programm zur Bindungsstellenanalyse, verwendet, um die möglichen Bindungsstellen vorherzusagen. Diese Taschen werden nach ihrer Neigung zur Ligandenbindung (PLB) eingestuft. CNOT7 ist ein Rezeptor ohne verfügbare kokristallisierte PDB-Struktur. Daher nutzten die Forscher zur Unterstützung unserer Studie das MOE-SiteFinder-Tool. Dabei stützten sie sich auf Hinweise aus früheren Literaturstellen, in denen über mehrere essentielle Aminosäurereste berichtet wurde, die an Ligand-CNOT7-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, wie Glu247. Tyr260 und Glu278 (34,35) wurden als relativ signifikant identifiziert.

3.3.2. Kuration des Liganden-Datensatzes Das in MOE implementierte „Builder-Programm“ wurde zur Modellierung von sechs Liganden in der Studie verwendet; Vitamin E, Colchicin, Prodigiosin, Riboflavin, Telmisartan und Pioglitazon, wobei alle möglichen Konformationen beim physiologischen pH-Wert erhalten wurden.

3.3.3. Docking-Simulationen Das Andocken der erhaltenen Konformationen der sechs Liganden wurde mithilfe von Platzierungs- und Verfeinerungsalgorithmen des MOE-Programms durchgeführt. Beim anfänglichen Andocken der Moleküle an den aktiven Stellen wurden die „Triangle Matcher“-Platzierungsmethode und die „London dG“-Bewertungsfunktion verwendet. Eine weitere Verfeinerung der Andockhaltungen nach der Platzierung wurde mithilfe der Bewertungsmethode „GBVI/WSA dG“ erreicht. Die Posen mit minimaler Energie wurden zur Visualisierung der Bindungswechselwirkungen sowie der Belegung der Bindungsstelle der Rezeptoren verwendet.

3.4. Statistische Analyse 3.4.1. Die gesammelten Daten wurden mit der Software „Statistical Package for Social Science“ (SPSS, Version 17, Chicago, IL, USA) aufgezeichnet und analysiert.

3.4.2. Qualitative Daten wurden als Häufigkeiten (n) und Prozentsätze (%) dargestellt. 3.4.3. Der Test auf quantitative Datennormalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Rechner durchgeführt. Normalverteilte Variablen wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt und mithilfe des Student-T-Tests für zwei unabhängige Stichproben zum Vergleich zweier Gruppen analysiert. Nicht normalverteilte Daten wurden als Mediane dargestellt (Interquartilbereiche als erstes bis drittes Quartil oder 25.–75. Quartil) und mithilfe des Mann-Whitney-Tests (U) analysiert.

3.4.4. Die ROC-Kurve wurde durchgeführt, um die besten Grenzwerte für die Kategorisierung der CNOT7- und LAIR-1-Serumspiegel in Untergruppen mit niedriger und hoher Expression zu ermitteln.

3.4.5. Der Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um den Zusammenhang zwischen CNOT7-Serumspiegeln und klinisch-pathologischen Parametern zu bewerten. Der Pearson-Korrelationstest wurde verwendet, um den Zusammenhang zwischen parametrischen Variablen zu bewerten. Punkt-biserielle Korrelationen wurden verwendet, um die Korrelation zwischen Parametern zu bestimmen, wenn einer von ihnen eine dichotome Variable war.

3.4.6. Das Signifikanzniveau wurde auf P < 0,05 und das Konfidenzniveau (KI) bzw. Intervall auf 95 % bzw. 5 % festgelegt.