Implicación de la expresión de la subunidad 7 del complejo CCR4-NOT en la resistencia de las células asesinas naturales en el cáncer de mama metastásico (CCR4-NOT)

1. Introducción 1.1. Problema de investigación. El cáncer de mama (CM) es la principal causa de muerte por cáncer en las mujeres (1,2). La principal causa de esta mortalidad es la diseminación metastásica a otros órganos (3). La metástasis ocurre cuando las células tumorales adquieren características invasivas (4) y la capacidad de escapar de la inmunidad antitumoral; respuestas inmunes innatas y adaptativas importantes para el control de tumores (5,6). Se informó que la progresión de la CM acompañaba a un deterioro importante de la maduración de las células asesinas naturales (NK) de la sangre periférica y de las funciones citotóxicas (7). Varios estudios de perfiles de expresión genética han demostrado que un mejor resultado se asocia con un fuerte infiltrado citotóxico que contiene células NK (8,9). Estos datos sugieren que la progresión de la BC está relacionada con la eficacia inmune antitumoral de las células NK, las células T y las células B. Sin embargo, no se ha investigado en profundidad cómo la progresión de BC afecta el fenotipo de las células NK periféricas.

La actividad de las células NK se determina activando e inhibiendo los receptores presentes en las células NK que se activan durante el reconocimiento de la célula diana (en este caso, célula tumoral), induciendo una vía de señalización celular positiva o negativa, respectivamente. La integración de estas señales opuestas determina el peso de activación de las células NK (10). Estudios recientes han demostrado que varias moléculas, en particular factores inhibidores, que a menudo se encuentran en el microambiente tumoral (TME, por sus siglas en inglés) pueden alterar drásticamente el fenotipo y las funciones de las células NK (11,12), lo que resulta en una disminución de la expresión de los receptores activadores de las células NK y un aumento de la expresión de los receptores inhibidores (como LAIR-1 que se detectó previamente en muestras de sangre clínicas de CHC, células T citotóxicas (13). Estos pueden promover la progresión de la BC y se correlacionarían con la disminución de la función citotóxica de las células inmunitarias que encuentran las células NK y las células T o B (14).

1.2. Finalidad y Objetivos. Para explorar el papel de CNOT7 relacionado con la resistencia de las células inmunitarias en la metástasis de BC, los investigadores intentaron medir los niveles séricos de CNOT7 en una cohorte de pacientes egipcias de BC en relación con los parámetros clínico-patológicos. Se midió la expresión de tejido CNOT7 en muestras de tejido de BC categorizadas como tumor metastásico versus no metastásico junto con el margen de tejido no tumoral adyacente. Además, se cuantificó el receptor inhibidor de las células NK, a saber; Niveles séricos de LAIR-1, cuya sobreexpresión estaría relacionada con las características agresivas del BC y los resultados clínicos adversos (22) manifestados como TNM. La correlación de CNOT7 con los niveles sanguíneos de LAIR-1 se evaluará clínicamente y se confirmará o implementará mediante búsqueda en bases de datos bioinformáticas y análisis in silico. Según los investigadores, están buscando el mecanismo de metástasis de BC, no solo explorando los niveles sanguíneos de CNOT7 o LAIR1, por lo tanto, están buscando más opciones terapéuticas, a través del acoplamiento molecular de CNOT7 o mediante el bloqueo de sus vías posteriores o la interacción de redes de genes efectores, ya sea como potencial prometedor. Opciones de tratamiento. Donde, estas vías e interacciones se recuperarán de la búsqueda de vías de KEGG, se abordarán en mayor profundidad a través de interacciones extraídas de texto o búsquedas en bases de datos bioinformáticas in silico seleccionadas.

2.1. Participantes del estudio 2.1.1. Aprobación Ética y Consentimiento Informado para participar. La aprobación ética se obtuvo del Comité Ético de Investigación de la junta de revisión de la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain Shams (REC ID# 48, 20 de octubre de 2021).

2.1.2. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de la Asociación Médica Mundial (WMA) cumpliendo con la Declaración de principios éticos de Helsinki para investigaciones médicas con seres humanos, versión revisada de julio de 2018, donde todos los individuos participantes firmaron el consentimiento informado (CI) éticamente aprobado.

2.1.3. Grupos de pacientes de BC. 90 pacientes femeninas con cáncer de mama, voluntarias en el estudio, diagnosticadas con cáncer de mama invasivo primario (no metastásico) (46 pacientes) o cáncer de mama metastásico (44 pacientes). Los pacientes se inscribieron al azar en el Departamento de Oncología Clínica de la Facultad de Medicina de los Hospitales Universitarios de Mansoura, Universidad de Mansoura, Mansoura, Egipto, después de firmar el CI.

2.1.4. El diagnóstico de CM se realizó mediante mamografía y resonancia magnética (RM). Se recopiló y registró la historia completa de todos los participantes del estudio (n = 90).

Se recolectaron muestras de sangre y bloques de tejido de parafina para aquellos que cumplieron con los criterios de inclusión y firmaron el CI.

2.1.5. Características clínicas y patológicas de los pacientes. Para todos los participantes de BC, se registraron los antecedentes familiares completos de enfermedad/cáncer, así como el estado diabético de los pacientes (sí versus no), el número de embarazos (ya sea menos o más de 2), el estado menopáusico (antes versus pos) y tratamiento(s) recibido(s) (quimioterapia neoadyuvante, quimioterapia adyuvante, terapia endocrina o mastectomía). El estado actual del cáncer individual de los pacientes y la evaluación clínica del tumor, realizada en la Facultad de Medicina del Hospital Universitario de Mansoura, Universidad de Mansoura, utilizando la categorización tumor-nódulo-metástasis (TNM) de acuerdo con la octava edición del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer ( AJCC) manual de estadificación y la escala Bloom-Richardson para clasificación histológica (24) recopilados de los archivos de datos de los pacientes, después de que se tomó una biopsia en el momento de la exploración/examen quirúrgico del BC.

Resultados de inmunohistoquímica (IHC) para el índice de proliferación Ki-67 (bajo o alto), el estado del receptor de estrógeno (ER), el receptor de progesterona (PR) y el receptor 2 de crecimiento epidérmico humano (HER2/neu) (cada uno positivo o negativo), índice de masa corporal (IMC) kg/m2 (normal, sobrepeso y obesidad 18,5-24,9, 25-29,9 y ≥30 kg/m2, respectivamente) (25), se recogieron el estado de los ganglios linfáticos (LN) (ninguno N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) y la edad en años. de los archivos de los pacientes y tabulados para el análisis estadístico.

Subtipo molecular de BC (27) si es de tipo luminal (ER+ y/o PR+), sobreexpresión de HER-2 (ER-, PR-, HER-2+) o BC triple negativo (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) y los subtipos histológicos de BC (28), si se trataba de carcinoma ductal invasivo (IDC) o no, se registraron para el análisis de correlación.

3. Métodos 3.1. Análisis Bioquímico 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 se evaluó utilizando el kit ELISA Human CCR4 NOT subunidad 7 del complejo de transcripción (CNOT7), Mybiosource, EE. UU., siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, los estándares y las muestras de suero de los grupos BC no metastásico y BC metastásico se incubaron junto con el conjugado CNOT7-HRP en una placa ELISA prerecubierta con anticuerpo anti-CNOT7 suministrada por el fabricante durante una hora a 37 °C. Después del período de incubación, los pocillos se decantaron y se lavaron cinco veces manualmente utilizando un tampón de lavado prediluido proporcionado por el fabricante. Los pocillos se incubaron con un sustrato para la enzima HRP durante una hora a 37°C. Finalmente, se añadió una solución de parada para detener la reacción. La intensidad del color producido se midió espectrofotométricamente a 450 nm en un lector de microplacas. Se trazó una curva estándar que relaciona la intensidad del color (densidad óptica (O.D.)) con la concentración de estándares. La concentración de CNOT7 en cada muestra se interpoló a partir de esta curva estándar (archivo complementario).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 se evaluó utilizando el kit Human LAIR-1 ELISA, Mybiosource, EE. UU. Los estándares y las muestras se pipetearon en los pocillos de una placa ELISA previamente recubierta con un anticuerpo específico LAIR-1 suministrado por el fabricante. Luego se cubrió la placa y se incubó a 37°C durante 45 min. seguido de un paso de lavado manual 5 veces usando tampón de lavado que se diluyó previamente. Se añadió a la placa un anticuerpo de detección conjugado con HRP y se incubó nuevamente a la misma temperatura durante 30 min. Posteriormente, la placa se lavó como se explicó anteriormente y se incubó con soluciones de cromógeno durante 15 min. seguido de un paso final de agregar solución de parada. La intensidad del color se midió espectrofotométricamente a 450 nm en un lector de microplacas. Se traza una curva estándar que relaciona la intensidad del color (O.D.) con la concentración de estándares. La concentración de LAIR-1 en cada muestra se interpoló a partir de esta curva estándar (archivo complementario). Los estándares se prepararon a partir de una solución madre y un diluyente estándar proporcionado por el fabricante, produciendo una serie de diluciones dobles 3.1.1.3. s.ELISA de insulina El ensayo de insulina sérica se realizó utilizando el kit ELISA de Hyperion Inc., Miami, FL, EE. UU. La intensidad del color de la muestra de prueba está directamente relacionada inversamente con su concentración de insulina. El nivel normal de insulina en adultos es de 0 a 25 mU/L.

3.1.2. Inmunohistoquímica 3.1.2.1. CNOT7 Protocolo de tinción IHC Utilizando secciones de parafina montadas en portaobjetos cargados positivamente utilizando la técnica del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC) (29). Las secciones de cada grupo se trataron con CNOT7 (M01) (ABNOVA, Cat# H00029883-M01, anticuerpo monoclonal, clon 2F6) a una dilución de 1:25 antes de exponerlas a los productos químicos necesarios para el método ABC (kit Vectastain ABC-HRP, Vector laboratorios). Para detectar complejos antígeno-anticuerpo, la expresión del marcador se marcó con peroxidasa y se coloreó con diaminobencidina (DAB, fabricado por Sigma). Se incluyeron controles negativos utilizando suero no inmune en lugar de los anticuerpos primarios o secundarios. Se utilizó el microscopio Leica (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Suiza) para evaluar las secciones teñidas con IHC (Leica Microsystems, Suiza).

3.1.2.2. Evaluación cuantitativa de los resultados de CNOT7 IHC "% de área" En cada sección seriada de los grupos de pacientes analizados, se eligieron para el examen seis campos de alta potencia (x 400) con inmunotinción marrón positiva. El% de área de las secciones teñidas con CNOT7 se calculó utilizando el sistema informático analizador de imágenes Leica QWin 500 (Reino Unido). Este analizador de imágenes constaba de un microscopio Leica, una cámara de vídeo en color, un monitor en color y un disco duro de un ordenador personal Leica IBM vinculado al microscopio y gestionado por el software Leica QWin 500.

Los datos del porcentaje de área se informaron estadísticamente en términos de media y error estándar de la media (media ± SEM) para ocho imágenes de cuatro muestras no metastásicas y cuatro muestras metastásicas.

3.2. Análisis Bioinformático in silico 3.2.1. Cáncer de mama Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Actualizado el 28 de junio de 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) para explorar la correlación entre CNOT7 y LAIR1.

3.2.2. Módulo funcional de LinkedOmics utilizado para realizar análisis del proceso biológico de ontología genética (GO_BP) con análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Interacciones gen-gen y vías a partir de bases de datos seleccionadas in silico y extracción de textos mediante Genome Browser para genes objetivo utilizando la Universidad de California Santa Cruz (UCSC) (32) Instituto de genómica http://genome.ucsc.edu/index.html Se recuperaron las interacciones de los genes LAIR1 y CNOT7, mencionando fármacos inhibidores conocidos de DrugBank.

3.2.4. Interacción proteína-proteína (PPI) de la base de datos de la herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas interactuantes (STRING) versión 11.5 https://string-db.org/ que predice interacciones basadas en datos experimentales relevantes, resultados de secuenciación y literatura de >1100 organismos completamente secuenciados (33). Consultado el 20 de enero de 2023 para explorar las proteínas que interactúan con LAIR-1.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Exploración de patrones de expresión genética en tejidos normales y tumorales (GENT2) con supervivencia http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Acoplamiento Molecular: 3.3.1. Preparación de las estructuras proteicas de LAIR-1 y CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Del banco de datos de proteínas (PDB) https:// www.rcsb.org/search la estructura cristalina de Human LAIR-1 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Después de cargar las estructuras en el entorno operativo molecular (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Plataforma integrada de diseño molecular asistido por computadora, se prepararon utilizando los parámetros predeterminados en el 'Panel QuickPrep', incluida la eliminación de moléculas de agua, la adición de átomos de hidrógeno a la estructura de la proteína, el ajuste de los estados de protonación y la minimización de la energía de las estructuras de la proteína con Amber10. :Campo de fuerza EHT.

Dado que esas estructuras cristalinas no se cocristalizaron con ningún ligando, se utilizó MOE SiteFinder, un programa para análisis de sitios de unión equipado en el MOE, para predecir los posibles sitios de unión. Esos bolsillos se clasifican según su propensión a unirse a ligandos (PLB). CNOT7 es un receptor sin estructura cocristalizada de PDB disponible, por lo tanto, los investigadores utilizaron la herramienta MOE siteFinder para ayudar en nuestro estudio, con la guía de literatura previa que informa varios residuos de aminoácidos esenciales involucrados en las interacciones entre ligando y proteína CNOT7 como Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) se han identificado como relativamente significativos.

3.3.2. Curación del conjunto de datos de ligandos El 'programa constructor' implementado en MOE se utilizó para modelar seis ligandos en el estudio; Vitamina E, Colchicina, Prodigiosina, Riboflavina, Telmisartán y Pioglitazona, donde se obtuvieron todas las conformaciones posibles al pH fisiológico.

3.3.3. Simulaciones de acoplamiento El acoplamiento de las conformaciones obtenidas de los seis ligandos se llevó a cabo utilizando algoritmos de colocación y refinamiento del programa MOE. El acoplamiento inicial de las moléculas en los sitios activos utilizó el método de colocación 'Triangle Matcher' y la función de puntuación 'London dG'. Se logró un mayor refinamiento de las posturas de acoplamiento después de la colocación utilizando el método de puntuación 'GBVI/WSA dG'. Las posturas con mínima energía se utilizaron para visualizar las interacciones de unión, así como la ocupación del sitio de unión de los receptores.

3.4. Análisis estadístico 3.4.1. Los datos recopilados se registraron y analizaron utilizando el software Statistical Package for Social Science (SPSS, versión 17, Chicago, IL, EE. UU.).

3.4.2. Los datos cualitativos se presentaron como frecuencias (n) y porcentajes (%). 3.4.3. La prueba de normalidad de los datos cuantitativos se realizó utilizando la calculadora Shapiro-Wilk. Las variables distribuidas normalmente se representaron como media ± SEM y se analizaron utilizando la prueba t de Student de dos muestras independientes para comparar dos grupos. Los datos que no estaban distribuidos normalmente se presentaron como medianas (rango intercuartil como primer a tercer cuartil o cuartil 25 a 75) y se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney (U).

3.4.4. Se realizó una curva ROC para detectar los mejores puntos de corte para categorizar los niveles séricos de CNOT7 y LAIR-1 en subgrupos de expresión baja y alta.

3.4.5. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para evaluar la asociación entre los niveles séricos de CNOT7 y los parámetros clínico-patológicos. Se utilizó la prueba de correlación de Pearson para evaluar la asociación entre variables paramétricas. Se utilizaron correlaciones punto-biserial para determinar la correlación entre parámetros cuando uno de ellos era una variable dicotómica.

3.4.6. El nivel de significancia se fijó en P<0,05 y el nivel de confianza (C.I) o intervalo en 95% y 5%, respectivamente.