CCR4-NOT:n monimutkaisen alayksikön 7 ilmentymisen merkitys luonnollisessa tappajasolujen resistenssissä metastaattisessa rintasyövässä (CCR4-NOT)

1. Johdanto 1.1. Tutkimusongelma. Rintasyöpä (BC) on naisten pääasiallinen syöpäkuolemien syy (1,2). Tämän kuolleisuuden pääsyy on etäpesäkkeiden leviäminen muihin elimiin (3). Metastaasi tapahtuu, kun kasvainsolut saavat invasiivisia piirteitä (4) ja kyvyn paeta kasvaintenvastaisesta immuniteetista; synnynnäiset ja adaptiiviset immuunivasteet, jotka ovat tärkeitä kasvaimen hallinnassa (5, 6). Perifeerisen veren luonnollisen tappajasolun (NK) kypsymisen ja sytotoksisten toimintojen merkittävän heikkenemisen raportoitiin liittyneen BC:n etenemiseen (7). Useat geeniekspression profilointitutkimukset ovat osoittaneet, että parempi tulos liittyy vahvaan sytotoksiseen infiltraattiin, joka sisältää NK-soluja (8, 9). Nämä tiedot viittaavat siihen, että BC:n eteneminen liittyy NK-solujen, T-solujen ja B-solujen antituumori-immuunitehokkuuteen. Kuitenkin, kuinka BC:n eteneminen vaikuttaa perifeeristen NK-solujen fenotyyppiin, ei ole tutkittu runsaasti.

NK-solujen aktiivisuus määritetään aktivoimalla ja inhiboimalla NK-soluissa olevia reseptoreita, jotka laukeavat kohdesolun (tässä tuumorisolun) tunnistamisen aikana, indusoiden positiivisen tai negatiivisen solun signalointireitin, vastaavasti. Näiden vastakkaisten signaalien integraatio määrittää NK-solujen aktivaatiopainon (10). Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että useat molekyylit, erityisesti estävät tekijät, joita usein esiintyy kasvaimen mikroympäristössä (TME), voivat heikentää jyrkästi NK-solujen fenotyyppiä ja toimintoja (11, 12), mikä johtaa aktivoivien NK-solureseptorien ilmentymisen vähenemiseen ja lisääntyneeseen NK-solujen ilmentymiseen. estävät reseptorit (kuten LAIR-1, joka havaittiin aiemmin kliinisissä HCC-verinäytteissä T-sytotoksisissa soluissa (13). Nämä voivat edistää BC:n etenemistä ja korreloivat NK-solujen ja T-solujen tai B-solujen kohtaaman heikentyneen immuunisolujen sytotoksisen toiminnan kanssa (14).

1.2. Tavoitteet ja tavoitteet. Tutkiakseen CNOT7:n roolia, joka liittyy immuunisolujen resistenssiin BC-etäpesäkkeissä, tutkijat yrittivät mitata CNOT7:n seerumitasoja egyptiläisten BC-potilaiden kohortissa suhteessa kliinisiin patologisiin parametreihin. CNOT7-kudosekspressio BC-kudosnäytteissä, jotka luokiteltiin metastaattisiksi vs. ei-metastaattisiksi tuumoreiksi viereisen ei-kasvainkudosmarginaalin ohella, mitattiin. Lisäksi kvantifioitiin inhiboiva reseptori NK-soluissa, nimittäin; LAIR-1 seerumitasot, joiden yli-ilmentyminen olisi yhteydessä aggressiivisiin BC-ominaisuuksiin ja haitallisiin kliinisiin tuloksiin (22), jotka ilmenevät TNM:nä. CNOT7:n korrelaatio LAIR-1-veritasojen kanssa on arvioitava kliinisesti ja vahvistettava tai esitettävä bioinformatiikan tietokantahaun ja in silico -analyysin avulla. Tutkijat etsivät BC-metastaasimekanismia, eivät pelkästään CNOT7- tai LAIR1-veren tasoja, vaan etsivät lisää terapeuttisia vaihtoehtoja CNOT7-molekyylitelakan kautta tai estämällä sen myötävirtareittejä tai efektorigeeni-geeniverkkojen vuorovaikutusta, joko mahdollisena lupaavana hoitovaihtoehdot. Mistä nämä reitit ja vuorovaikutukset haetaan KEGG-polkuhausta, ja niitä käsitellään edelleen tekstilouhittujen vuorovaikutusten tai haun avulla kuroituihin in silico bioinformatiikan tietokantoihin.

2.1. Tutkimukseen osallistujat 2.1.1. Eettinen hyväksyntä ja tietoinen suostumus osallistumiseen. Eettinen hyväksyntä saatiin Ain Shams Universityn farmasian tiedekunnan tarkastuslautakunnan Research Ethical Committeelta (REC ID# 48, 20.10.2021).

2.1.2. Tutkimus toteutettiin Maailman lääketieteellisen liiton (WMA) ohjeistuksen mukaisesti, joka täyttää Helsingin ihmisiin kohdistuvan lääketieteellisen tutkimuksen eettiset periaatteet, tarkistetun heinäkuun 2018 version, jossa kaikki osallistujat allekirjoittivat eettisesti hyväksytyn tietoisen suostumuksen (IC).

2.1.3. BC-potilasryhmät. 90 naispuolista BC-potilasta, jotka osallistuivat vapaaehtoisesti tutkimukseen, diagnosoitiin joko primaarinen naiivi (ei-metastaattinen) invasiivinen BC (46 potilasta) tai metastaattinen BC (44 potilasta). Potilaat otettiin satunnaisesti mukaan kliinisen onkologian osastolta, lääketieteellisen tiedekunnan Mansouran yliopistollisiin sairaaloihin, Mansouran yliopistoon Mansourassa, Egyptissä, IC:n allekirjoittamisen jälkeen.

2.1.4. BC-diagnoosi tehtiin mammografialla ja magneettikuvauksella (MRI). Täydellinen historia kerättiin ja kirjattiin kaikilta tutkimukseen osallistuneilta (n = 90).

Verinäytteet ja kudosparafiinilohkot kerättiin niiltä, ​​jotka täyttivät sisällyttämiskriteerit ja allekirjoittivat IC:n.

2.1.5. Potilaiden kliiniset ja patologiset ominaisuudet. Kaikille BC-osallistujille kirjattiin koko perheen sairaus/syöpähistoria sekä potilaiden diabeettinen tila (kyllä ​​vs ei), raskauksien lukumäärä (joko vähemmän tai enemmän kuin 2), vaihdevuodet (ennen vs. jälkeen) ja hoito(t) (neoadjuvanttikemoterapia, adjuvanttikemoterapia, endokriininen hoito tai rinnanpoisto). Potilaiden yksilöllinen tämänhetkinen syöpätila ja kasvaimen kliininen arviointi, joka on tehty Mansouran yliopiston lääketieteellisessä tiedekunnassa, Mansouran yliopistossa, käyttäen tuumorisolmumetastaasi (TNM) -luokitusta American Joint Committee on Cancer -julkaisun 8. painoksen mukaisesti. AJCC) -vaiheen käsikirja ja Bloom-Richardsonin asteikko histologista arviointia varten (24), jotka on kerätty potilaiden tiedostoista sen jälkeen, kun biopsia otettiin BC-kirurgisen tutkimuksen/tutkimuksen aikana.

Immunohistokemian (IHC) tulokset proliferaatioindeksille Ki-67 (joko matala tai korkea), estrogeenireseptorin (ER), progesteronireseptorin (PR) tilalle ja ihmisen epidermaalisen kasvun reseptorille 2 (HER2/neu) (joko positiivinen tai korkea). negatiivinen), painoindeksi (BMI) kg/m2 (normaali, ylipainoinen ja lihava 18,5-24,9, 25-29,9 ja ≥ 30 kg/m2) (25), imusolmukkeiden (LN) tila (ei yhtään N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) ja ikä vuosina kerättiin. potilaiden tiedostoista ja taulukoitu tilastollista analyysiä varten.

Molekyyli-BC-alatyyppi (27), jos luminaalinen kaltainen (ER+ ja/tai PR+), HER-2-yliekspressio (ER-, PR-, HER-2+) tai kolmoisnegatiivinen BC (TNBC) (ER-, PR-, HER) -2-) ja histologiset BC-alatyypit (28), olipa kyseessä invasiivinen duktaalinen karsinooma (IDC) tai ei, kirjattiin kaikki korrelaatioanalyysiä varten.

3. Menetelmät 3.1. Biokemiallinen analyysi 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 arvioitiin käyttämällä Human CCR4 NOT -transkriptiokompleksin alayksikköä 7 (CNOT7) ELISA Kit, Mybiosource, USA, valmistajan ohjeita noudattaen. Lyhyesti sanottuna sekä ei-metastaattisten BC- että metastaattisten BC-ryhmien standardeja ja seeruminäytteitä inkuboitiin yhdessä CNOT7-HRP-konjugaatin kanssa valmistajan toimittamassa anti-CNOT7-vasta-aineella esipäällystetyssä ELISA-levyssä tunnin ajan 37 °C:ssa. Inkubointijakson jälkeen kuopat dekantoitiin ja pestiin viisi kertaa manuaalisesti käyttämällä valmistajan toimittamaa esilaimennettua pesupuskuria. Kuoppia inkuboitiin HRP-entsyymin substraatin kanssa tunnin ajan 37 °C:ssa. Lopuksi lisättiin pysäytysliuosta reaktion pysäyttämiseksi. Syntynyt värin intensiteetti mitattiin spektrofotometrisesti 450 nm:ssä mikrolevylukijassa. Piirrettiin standardikäyrä, joka suhteutti värin intensiteetin (optinen tiheys (O.D.)) standardien pitoisuuteen. CNOT7-pitoisuus kussakin näytteessä interpoloitiin tästä standardikäyrästä (lisätiedosto).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 arvioitiin käyttämällä Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, USA. Standardit ja näytteet pipetoitiin ELISA-levyn kuoppiin, jotka oli esipäällystetty valmistajan toimittamalla LAIR-1-spesifisellä vasta-aineella. Sitten levy peitettiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 45 minuuttia. jota seurasi 5-kertainen manuaalinen pesuvaihe käyttäen pesupuskuria, joka oli aiemmin laimennettu. HRP-konjugoitu detektiovasta-aine lisättiin levylle ja sitä inkuboitiin uudelleen samassa lämpötilassa 30 minuuttia. Sen jälkeen levy pestiin aiemmin selitetyllä tavalla ja inkuboitiin kromogeeniliuosten kanssa 15 minuuttia. jota seuraa viimeinen vaihe pysäytysliuoksen lisäämisellä. Värin intensiteetti mitattiin spektrofotometrisesti 450 nm:ssä mikrolevylukijassa. Piirretään standardikäyrä, joka suhteuttaa värin intensiteetin (O.D.) standardien pitoisuuteen. LAIR-1-pitoisuus kussakin näytteessä interpoloitiin tästä standardikäyrästä (lisätiedosto). Standardit valmistettiin kantaliuoksesta ja valmistajan toimittamasta standardilaimentimesta, joka tuotti kaksinkertaisen laimennussarjan 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Seerumin insuliinimääritys suoritettiin käyttämällä Hyperion Inc.:tä, Miami, FL, USA ELISA-pakkausta. Testinäytteen värin intensiteetti on suoraan käänteisessä suhteessa sen insuliinipitoisuuteen. Normaali aikuisten insuliinitaso on 0-25 mU/l.

3.1.2. Immunohistokemia 3.1.2.1. CNOT7 IHC-värjäysprotokolla Positiivisesti varautuneille objektilaseille asennettuja parafiinileikkeitä käyttäen avidiini-biotiini-peroksidaasikompleksi (ABC) -tekniikkaa (29). Jokaisen ryhmän leikkeet käsiteltiin CNOT7:llä (M01) (ABNOVA, luettelonro H00029883-M01, monoklonaalinen vasta-aine, klooni 2F6) 1:25-laimennuksella ennen kuin ne altistettiin ABC-menetelmässä tarvittaville kemikaaleille (Vectastain ABC-HRP -sarja, Vector laboratoriot). Antigeeni-vasta-ainekompleksien havaitsemiseksi markkeriekspressio leimattiin peroksidaasilla ja värjättiin diaminobentsidiinillä (DAB, valmistaja Sigma). Negatiiviset kontrollit otettiin mukaan käyttämällä ei-immuuniseerumia primääristen tai sekundaaristen vasta-aineiden sijasta. Leica-mikroskooppia (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Sveitsi) käytettiin arvioimaan IHC-värjättyjä leikkeitä (Leica Microsystems, Sveitsi).

3.1.2.2. CNOT7 IHC -tulosten kvantitatiivinen arviointi "Ala-%" Jokaisessa analysoitujen potilasryhmien sarjaosassa valittiin tutkittavaksi kuusi suuritehoista kenttää (x 400), joissa oli positiivinen ruskea immunovärjäys. CNOT7-värjättyjen leikkeiden pinta-ala-% laskettiin käyttämällä Leica QWin 500 -kuvaanalysaattoritietokonejärjestelmää (UK). Tämä kuva-analysaattori sisälsi Leica-mikroskoopin, värillisen videokameran, värillisen näytön ja Leica IBM:n henkilökohtaisen tietokoneen kiintolevyn, joka oli linkitetty mikroskooppiin ja jota hallinnoi Leica QWin 500 -ohjelmisto.

Pinta-ala-prosenttitiedot ilmoitettiin tilastollisesti keskiarvon ja keskivirheen (keskiarvo ± S.E.M) muodossa kahdeksalle kuvalle neljästä ei-metastaattisesta näytteestä ja neljästä metastaattisesta näytteestä.

3.2. In silico Bioinformatic Analysis 3.2.1. Rintasyöpä Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Päivitetty 28. kesäkuuta 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) tutkiaksesi korrelaatiota CNOT7:n ja LAIR1:n välillä.

3.2.2. LinkedOmicsin toimintomoduulia käytetään geeniontologian biologisen prosessin (GO_BP) analysointiin geenijoukon rikastusanalyysillä (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Geenien ja geenien vuorovaikutus ja reitit in silico kuratoiduista tietokannoista ja tekstinlouhinnasta kohdegeenien genomiselaimen kautta käyttäen Kalifornian yliopiston Santa Cruiz (UCSC) (32) Genomiikkainstituutti http://genome.ucsc.edu/index.html LAIR1- ja CNOT7-geenien vuorovaikutukset haettiin mainitsemalla DrugBankin tunnetut estäjälääkkeet.

3.2.4. Protein-Protein Interaction (PPI) Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) -tietokannan versiosta 11.5 https://string-db.org/, joka ennustaa vuorovaikutuksia asiaankuuluvien kokeellisten tietojen, sekvensointitulosten ja kirjallisuuden perusteella >1100 täysin sekvensoitua organismia (33). Käytetty 20. tammikuuta 2023 LAIR-1-vuorovaikutteisten proteiinien tutkimiseksi.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Geeniekspressiomallien tutkiminen normaaleissa ja kasvainkudoksissa (GENT2) selviytymisen avulla http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Molekyylitelakka: 3.3.1. LAIR-1:n ja CNOT7:n proteiinirakenteiden valmistus https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Proteiinitietopankista (PDB) https:// www.rcsb.org/search Human LAIR-1:n kiderakenne (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Kun rakenteet on ladattu molekylaariseen toimintaympäristöön (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Integroitu tietokoneavusteinen molekyylisuunnittelualusta, ne valmistettiin käyttämällä QuickPrep-paneelin oletusparametreja, mukaan lukien vesimolekyylien poistaminen, vetyatomien lisääminen proteiinirakenteeseen, protonaatiotilojen säätäminen ja proteiinirakenteiden energian minimoiminen Amber10:llä. : EHT voimakenttä.

Koska näitä kiderakenteita ei kiteytetty yhdessä minkään ligandien kanssa, mahdollisten sitoutumiskohtien ennustamiseen käytettiin MOE SiteFinder -ohjelmaa, MOE:ssä varustettua sitoutumiskohdan analysointiohjelmaa. Nämä taskut luokitellaan niiden ligandisitoutumisalttiuden (PLB) perusteella. CNOT7 on reseptori, jolla ei ole saatavilla PDB-yhteiskiteytettyä rakennetta, joten tutkijat käyttivät MOE siteFinder -työkalua apuna tutkimuksessamme aiempien kirjallisuuksien ohjeiden mukaisesti, jotka raportoivat useita välttämättömiä aminohappotähteitä, jotka ovat mukana ligandin ja CNOT7:n proteiinien vuorovaikutuksessa, kuten Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) on tunnistettu suhteellisen merkittäviksi.

3.3.2. Liganditietojoukon kuratointi MOE:ssä toteutettua "builder-ohjelmaa" käytettiin kuuden ligandin mallintamiseen tutkimuksessa; E-vitamiini, kolkisiini, prodigiosiini, riboflaviini, telmisartaani ja pioglitatsoni, joissa saatiin kaikki mahdolliset konformaatiot fysiologisessa pH:ssa.

3.3.3. Telakointisimulaatiot Kuuden ligandin saatujen konformaatioiden telakointi suoritettiin MOE-ohjelman sijoitus- ja tarkennusalgoritmeilla. Molekyylien ensimmäinen telakointi aktiivisiin kohtiin käytti "Triangle Matcher" -sijoitusmenetelmää ja "London dG" -pisteytystoimintoa. Telakointiasennon sijoituksen jälkeinen tarkennus saavutettiin käyttämällä GBVI/WSA dG -pisteytysmenetelmää. Vähimmäisenergiaisia ​​asentoja käytettiin sitoutumisvuorovaikutusten visualisointiin sekä reseptorien sitoutumiskohdan miehitykseen.

3.4. Tilastollinen analyysi 3.4.1. Kerätyt tiedot tallennettiin ja analysoitiin käyttämällä Statistical Package for Social Science -ohjelmistoa (SPSS, versio 17, Chicago, IL, USA).

3.4.2. Laadulliset tiedot esitettiin frekvenssinä (n) ja prosentteina (%). 3.4.3. Kvantitatiivisen datan normaaliuden testi suoritettiin Shapiro-Wilk-laskimella. Normaalisti jakautuneet muuttujat esitettiin keskiarvona ± S.E.M ja analysoitiin käyttämällä kahta otoksesta riippumatonta Studentsin t-testiä kahden ryhmän vertailua varten. Ei normaalisti jakautuneet tiedot esitettiin mediaaneina (kvartiilien väliset vaihtelut ensimmäisistä kolmanteen kvartiileihin tai 25.-75. kvartiileihin) ja analysoitiin Mann-Whitney (U) -testillä.

3.4.4. ROC-käyrä suoritettiin parhaiden rajapisteiden havaitsemiseksi CNOT7- ja LAIR-1-seerumitasojen luokittelemiseksi alhaisen ja korkean ilmentymisen alaryhmiin.

3.4.5. Chi-neliö-testiä käytettiin arvioimaan CNOT7-seerumitasojen ja kliiniset patologisten parametrien välistä yhteyttä. Pearsonin korrelaatiotestiä käytettiin arvioimaan parametristen muuttujien välistä yhteyttä. Piste-bissarjakorrelaatioita käytettiin määrittämään parametrien välinen korrelaatio, kun yksi niistä oli dikotominen muuttuja.

3.4.6. Merkitystaso asetettiin arvoon P < 0,05 ja luottamustasolle (C.I) tai väliksi 95 % ja 5 %.