Implicazione dell'espressione della subunità 7 del complesso CCR4-NOT nella resistenza delle cellule natural killer nel cancro al seno metastatico (CCR4-NOT)

1. Introduzione 1.1. Problema di ricerca. Il cancro al seno (BC) è la causa principale di morte per cancro nelle donne (1,2). La causa principale di questa mortalità è la diffusione metastatica ad altri organi (3). La metastasi si verifica quando le cellule tumorali acquisiscono caratteristiche invasive (4) e la capacità di sfuggire all'immunità antitumorale; risposte immunitarie innate e adattative importanti per il controllo del tumore (5,6). È stato segnalato che una grave compromissione della maturazione delle cellule natural killer (NK) del sangue periferico e delle funzioni citotossiche accompagna la progressione del BC (7). Numerosi studi di profilazione dell'espressione genica hanno dimostrato che un risultato migliore è associato ad un forte infiltrato citotossico contenente cellule NK (8,9). Questi dati suggeriscono che la progressione del BC è legata all’efficienza immunitaria antitumorale delle cellule NK, delle cellule T e delle cellule B. Tuttavia, il modo in cui la progressione del BC influisce sul fenotipo delle cellule NK periferiche non è stato ampiamente studiato.

L'attività delle cellule NK è determinata dall'attivazione e dall'inibizione dei recettori presenti sulle cellule NK che vengono attivati ​​durante il riconoscimento della cellula bersaglio (in questo caso, cellula tumorale), inducendo rispettivamente una via di segnalazione cellulare positiva o negativa. L'integrazione di questi segnali opposti determina il peso di attivazione delle cellule NK (10). Studi recenti hanno dimostrato che diverse molecole, in particolare fattori inibitori, spesso presenti nel microambiente tumorale (TME) possono compromettere drasticamente il fenotipo e le funzioni delle cellule NK (11,12), determinando una diminuzione dell'espressione dei recettori attivanti delle cellule NK e un'aumentata espressione di i recettori inibitori (come LAIR-1 che è stato rilevato in precedenza in campioni di sangue clinici di HCC e cellule T-citotossiche (13). Questi potrebbero promuovere la progressione del BC e sarebbero correlati alla diminuzione della funzione citotossica delle cellule immunitarie incontrata dalle cellule NK e dalle cellule T o B (14).

1.2. Scopo e obiettivi. Per esplorare il ruolo di CNOT7 correlato alla resistenza delle cellule immunitarie nelle metastasi del BC, i ricercatori hanno tentato di misurare i livelli sierici di CNOT7 nella coorte di pazienti egiziani con BC in relazione ai parametri clinicopatologici. È stata misurata l'espressione del tessuto CNOT7 nei campioni di tessuto BC classificati come tumore metastatico vs non metastatico insieme al margine di tessuto non tumorale adiacente. Inoltre, è stato quantificato il recettore inibitorio sulle cellule NK; Livelli sierici di LAIR-1, la cui sovraespressione sarebbe collegata alle caratteristiche aggressive del BC e agli esiti clinici avversi (22) manifestati come TNM. La correlazione di CNOT7 con i livelli ematici di LAIR-1 deve essere valutata clinicamente e da confermare o implementare tramite ricerca nei database bioinformatici e analisi in silico. Secondo i ricercatori stanno cercando il meccanismo di metastasi del BCOT, non solo esplorando i livelli ematici di CNOT7 o LAIR1, quindi, trovando più opzioni terapeutiche, tramite l'aggancio molecolare di CNOT7 o bloccando i suoi percorsi a valle o l'interazione delle reti gene-gene effettore, sia come potenziale promettente opzioni di trattamento. Dove, questi percorsi e interazioni verranno recuperati dalla ricerca di percorsi KEGG, ulteriormente affrontati attraverso interazioni estratte da testo o ricerca in DB bioinformatici curati in silico.

2.1. Partecipanti allo studio 2.1.1. Approvazione Etica e Consenso Informato alla partecipazione. L'approvazione etica è stata ottenuta dal comitato etico di ricerca del comitato di revisione della Facoltà di Farmacia dell'Università di Ain Shams (REC ID n. 48, 20 ottobre 2021).

2.1.2. Lo studio è stato condotto secondo le linee guida della World Medical Association (WMA) che soddisfano i principi etici della Dichiarazione di Helsinki per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani, versione rivista del luglio 2018, in cui tutti i partecipanti hanno firmato il consenso informato (IC) eticamente approvato.

2.1.3. Gruppi di pazienti BC. 90 pazienti di sesso femminile con BC, volontarie nello studio, con diagnosi di BC invasivo primario naïve (non metastatico) (46 pazienti) o BC metastatico (44 pazienti). I pazienti sono stati arruolati in modo casuale dal Dipartimento di Oncologia Clinica, Facoltà di Medicina, Ospedali Universitari di Mansoura, Università di Mansoura, Mansoura, Egitto, dopo aver firmato l'IC.

2.1.4. La diagnosi di BC è stata effettuata con mammografia e risonanza magnetica (MRI). L'anamnesi completa è stata raccolta e registrata per tutti i partecipanti allo studio (n = 90).

Sono stati raccolti campioni di sangue e blocchi di paraffina tissutale per coloro che soddisfacevano i criteri di inclusione e avevano firmato l'IC.

2.1.5. Caratteristiche cliniche e patologiche dei pazienti. Per tutti i partecipanti al BC, è stata registrata l'anamnesi familiare completa di malattia/cancro, nonché lo stato diabetico dei pazienti (sì vs no), il numero di gravidanze (meno o più di 2), lo stato della menopausa (pre vs post) e trattamenti ricevuti (chemioterapia neoadiuvante, chemioterapia adiuvante, terapia endocrina o mastectomia). Stato attuale del cancro individuale dei pazienti e valutazione clinica del tumore, effettuata presso la Facoltà di Medicina, Ospedale Universitario di Mansoura, Università di Mansoura, utilizzando la categorizzazione dei linfonodi tumorali (TNM) secondo l'ottava edizione dell'American Joint Committee on Cancer ( AJCC) manuale di stadiazione e la scala Bloom-Richardson per la classificazione istologica (24) raccolti dai file di dati dei pazienti, dopo che è stata eseguita una biopsia al momento dell'esplorazione/esame chirurgico del BC.

Risultati immunoistochimici (IHC) per l'indice di proliferazione Ki-67 (basso o alto), lo stato del recettore degli estrogeni (ER), del recettore del progesterone (PR) e il recettore 2 della crescita epidermica umana (HER2/neu) (ciascuno positivo o negativo), indice di massa corporea (BMI) kg/m2 (normale, sovrappeso e obeso 18,5-24,9, 25-29,9 e ≥ 30 kg/m2, rispettivamente) (25), lo stato dei linfonodi (LN) (nessuno N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) e l'età in anni, sono stati tutti raccolti dai file dei pazienti e tabulati per l'analisi statistica.

Sottotipo molecolare di BC (27) se luminale simile (ER+ e/o PR+), sovraespressione di HER-2 (ER-, PR-, HER-2+) o BC triplo negativo (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) e sottotipi istologici di BC (28), se carcinoma duttale invasivo (IDC) o meno, sono stati tutti registrati per l'analisi di correlazione.

3. Metodi 3.1. Analisi biochimica 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 è stato valutato utilizzando il kit ELISA della subunità 7 del complesso di trascrizione NOT umano CCR4 (CNOT7), Mybiosource, USA, seguendo le istruzioni del produttore. In breve, gli standard e i campioni di siero dei gruppi BC non metastatico e metastatico sono stati incubati insieme al coniugato CNOT7-HRP in una piastra ELISA pre-rivestita con anticorpo anti-CNOT7 fornita dal produttore per un'ora a 37°C. Dopo il periodo di incubazione, i pozzetti sono stati decantati e lavati manualmente cinque volte utilizzando un tampone di lavaggio prediluito fornito dal produttore. Pozzetti incubati con un substrato per l'enzima HRP per un'ora a 37°C. Infine è stata aggiunta una soluzione di arresto per arrestare la reazione. L'intensità del colore prodotta è stata misurata spettrofotometricamente a 450 nm in un lettore di micropiastre. È stata tracciata una curva standard che mette in relazione l'intensità del colore (densità ottica (D.O.)) con la concentrazione degli standard. La concentrazione di CNOT7 in ciascun campione è stata interpolata da questa curva standard (file supplementare).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 è stato valutato utilizzando il kit Human LAIR-1 ELISA, Mybiosource, USA. Standard e campioni sono stati pipettati nei pozzetti di una piastra ELISA pre-rivestita con un anticorpo specifico LAIR-1 fornito dal produttore. La piastra è stata quindi coperta e incubata a 37°C per 45 minuti. seguita da una fase di lavaggio manuale per 5 volte utilizzando il tampone di lavaggio precedentemente diluito. Alla piastra è stato aggiunto un anticorpo di rilevamento coniugato con HRP ed è stato nuovamente incubato alla stessa temperatura per 30 minuti. Successivamente la piastra è stata lavata come spiegato in precedenza e incubata con soluzioni cromogene per 15 minuti. seguito da una fase finale di aggiunta della soluzione bloccante. L'intensità del colore è stata misurata spettrofotometricamente a 450 nm in un lettore di micropiastre. Viene tracciata una curva standard che mette in relazione l'intensità del colore (D.O.) con la concentrazione degli standard. La concentrazione di LAIR-1 in ciascun campione è stata interpolata da questa curva standard (file supplementare). Gli standard sono stati preparati da una soluzione madre e un diluente standard forniti dal produttore producendo una serie di diluizioni doppie 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Il test dell'insulina sierica è stato eseguito utilizzando il kit ELISA Hyperion Inc., Miami, FL, USA. L'intensità del colore del campione da testare è direttamente inversamente correlata alla sua concentrazione di insulina. Il livello normale di insulina negli adulti è compreso tra 0 e 25 mU/L.

3.1.2. Immunoistochimica 3.1.2.1. Protocollo di colorazione IHC CNOT7 Utilizzo di sezioni in paraffina montate su vetrini caricati positivamente utilizzando la tecnica del complesso avidina-biotina-perossidasi (ABC) (29). Le sezioni di ciascun gruppo sono state trattate con CNOT7 (M01) (ABNOVA, Cat# H00029883-M01, Anticorpo monoclonale, clone 2F6) alla diluizione 1:25 prima di essere esposte alle sostanze chimiche necessarie per il metodo ABC (kit Vectastain ABC-HRP, Vector laboratori). Per rilevare i complessi antigene-anticorpo, l'espressione del marcatore è stata marcata con perossidasi e colorata con diaminobenzidina (DAB, prodotta da Sigma). I controlli negativi sono stati inclusi utilizzando siero non immune al posto degli anticorpi primari o secondari. Il microscopio Leica (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Svizzera) è stato utilizzato per valutare le sezioni colorate IHC (Leica Microsystems, Svizzera).

3.1.2.2. Valutazione quantitativa dei risultati IHC CNOT7 "Area %" In ciascuna sezione seriale dei gruppi di pazienti analizzati, sono stati scelti per l'esame sei campi ad alta potenza (x 400) con immunocolorazione marrone positiva. L'area% delle sezioni colorate con CNOT7 è stata calcolata utilizzando il sistema informatico di analisi delle immagini Leica QWin 500 (Regno Unito). Questo analizzatore di immagini prevedeva un microscopio Leica, una videocamera a colori, un monitor a colori e un disco rigido di un personal computer Leica IBM collegato al microscopio e gestito dal software Leica QWin 500.

I dati relativi all'area% sono stati riportati statisticamente in termini di media ed errore standard della media (media ± S.E.M) per otto immagini provenienti da quattro campioni non metastatici e quattro campioni metastatici.

3.2. Analisi Bioinformatica in silico 3.2.1. Cancro al seno Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Aggiornato il 28 giugno 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) per esplorare la correlazione tra CNOT7 e LAIR1.

3.2.2. Modulo funzionale di LinkedOmics utilizzato per eseguire l'analisi del processo biologico Gene Ontology (GO_BP) con analisi di arricchimento del set di geni (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Interazioni e percorsi gene-gene da DB curati in silico ed estrazione di testo tramite Genome Browser per i geni target utilizzando l'Università della California Santa Cruiz (UCSC) (32) Istituto di genomica http://genome.ucsc.edu/index.html Sono state recuperate le interazioni dei geni LAIR1 e CNOT7, menzionando farmaci inibitori noti da DrugBank.

3.2.4. Protein-Protein Interaction (PPI) dal database Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versione 11.5 https://string-db.org/ che prevede le interazioni sulla base di dati sperimentali rilevanti, risultati di sequenziamento e letteratura da >1100 organismi completamente sequenziati (33). Accesso effettuato il 20 gennaio 2023 per esplorare le proteine ​​interagenti con LAIR-1.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Esplorazione dei modelli di espressione genica nei tessuti normali e tumorali (GENT2) con sopravvivenza http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Docking molecolare: 3.3.1. Preparazione delle strutture proteiche di LAIR-1 e CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Dalla banca dati delle proteine ​​(PDB) https:// www.rcsb.org/search la struttura cristallina di Human LAIR-1 (ID PDB: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Dopo aver caricato le strutture nell'ambiente operativo molecolare (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Piattaforma integrata di progettazione molecolare assistita da computer, sono stati preparati utilizzando i parametri predefiniti nel "Pannello QuickPrep", inclusa la rimozione delle molecole d'acqua, l'aggiunta di atomi di idrogeno alla struttura proteica, la regolazione degli stati di protonazione e la garanzia della minimizzazione energetica delle strutture proteiche con Amber10 : Campo di forza EHT.

Poiché tali strutture cristalline non erano co-cristallizzate con alcun ligando, è stato utilizzato MOE SiteFinder, un programma per l'analisi dei siti di legame equipaggiato nel MOE per prevedere i possibili siti di legame. Tali tasche sono classificate in base alla loro propensione al legame con i ligandi (PLB). CNOT7 è un recettore senza struttura co-cristallizzata PDB disponibile, pertanto, i ricercatori hanno utilizzato lo strumento MOE siteFinder per aiutare nel nostro studio, con la guida di letterature precedenti che riportavano diversi residui di amminoacidi essenziali coinvolti nelle interazioni ligando-proteina CNOT7 come Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) sono stati identificati come relativamente significativi.

3.3.2. Cura del set di dati dei ligandi Il "programma di creazione" implementato in MOE è stato utilizzato per modellare sei ligandi nello studio; Vitamina E, Colchicina, Prodigiosina, Riboflavina, Telmisartan e Pioglitazone, dove sono state ottenute tutte le possibili conformazioni al pH fisiologico.

3.3.3. Simulazioni di docking Il docking delle conformazioni ottenute dei sei ligandi è stato effettuato utilizzando algoritmi di posizionamento e raffinamento del programma MOE. L'aggancio iniziale delle molecole nei siti attivi ha utilizzato il metodo di posizionamento "Triangle Matcher" e la funzione di punteggio "London dG". Un ulteriore perfezionamento post-posizionamento delle pose di aggancio è stato ottenuto utilizzando il metodo di punteggio "GBVI/WSA dG". Le pose con energia minima sono state utilizzate per la visualizzazione delle interazioni di legame e dell'occupazione del sito di legame dei recettori.

3.4. Analisi statistica 3.4.1. I dati raccolti sono stati registrati e analizzati utilizzando il software Statistical Package for Social Science (SPSS, Versione 17, Chicago, IL, USA).

3.4.2. I dati qualitativi sono stati presentati come frequenze (n) e percentuali (%). 3.4.3. Il test per la normalità dei dati quantitativi è stato eseguito utilizzando il calcolatore Shapiro-Wilk. Le variabili normalmente distribuite sono state rappresentate come media ± S.E.M e analizzate utilizzando il test t di Student indipendente di due campioni per il confronto di due gruppi. I dati non distribuiti normalmente sono stati presentati come mediane (intervallo interquartile dal primo al terzo quartile o dal 25° al 75° quartile) e analizzati utilizzando il test di Mann-Whitney (U).

3.4.4. La curva ROC è stata eseguita per rilevare i migliori punti di cut-off per classificare i livelli sierici di CNOT7 e LAIR-1 in sottogruppi a bassa e alta espressione.

3.4.5. Il test Chi-quadrato è stato utilizzato per valutare l'associazione tra i livelli sierici di CNOT7 e i parametri clinicopatologici. Per valutare l’associazione tra variabili parametriche è stato utilizzato il test di correlazione di Pearson. Le correlazioni punto-biseriali sono state utilizzate per determinare la correlazione tra i parametri quando uno di essi era una variabile dicotomica.

3.4.6. Il livello di significatività è stato fissato a P<0,05 e il livello di confidenza (C.I) o intervallo rispettivamente al 95% e al 5%.