Implikation af CCR4-NOT kompleks underenhed 7-ekspression i naturlig dræbercelle-resistens i metastatisk brystkræft (CCR4-NOT)

1. Indledning 1.1. Forskningsproblem. Brystkræft (BC) er den primære årsag til kræftdødsfald hos kvinder (1,2). Hovedårsagen til denne dødelighed er metastatisk spredning til andre organer (3). Metastase opstår, når tumorceller erhverver invasive træk (4) og evnen til at undslippe antitumorimmunitet; medfødte og adaptive immunresponser vigtige for tumorkontrol (5,6). Større svækkelse af perifert blods naturlige dræber (NK) cellemodning og cytotoksiske funktioner blev rapporteret at ledsage BC-progression (7). Adskillige genekspressionsprofileringsstudier har vist, at et bedre resultat er forbundet med et stærkt cytotoksisk infiltrat indeholdende NK-celler (8,9). Disse data tyder på, at BC-progression er forbundet med antitumorimmuneffektiviteten af ​​NK-celler, T-celler og B-celler. Men hvordan BC-progression påvirker perifere NK-cellers fænotype er ikke rigeligt undersøgt.

Aktiviteten af ​​NK-celler bestemmes af aktiverende og inhiberende receptorer, der er til stede på NK-celler, som udløses under målcelle (heri, tumorcelle) genkendelse, hvilket inducerer henholdsvis en positiv eller en negativ cellesignalvej. Integrationen af ​​disse modsatte signaler bestemmer NK-celleaktiveringsvægt (10). Nylige undersøgelser har vist, at adskillige molekyler, især hæmmende faktorer, der ofte findes i tumormikromiljøet (TME), kan kraftigt svække NK-cellers fænotype og funktioner (11,12), hvilket resulterer i en nedsat ekspression af aktiverende NK-cellereceptorer og en øget ekspression af de hæmmende receptorer (som LAIR-1, der tidligere blev detekteret i HCC kliniske blodprøver T-cytotoksiske celler (13). Disse kan fremme BC-progression og ville korrelere med den nedsatte immuncellecytotoksiske funktion, som NK-celler og T-celler eller B-celler støder på (14).

1.2. Mål og mål. For at udforske CNOT7-rollen relateret til immuncellers modstand i BC-metastaser, forsøgte efterforskerne at måle serumniveauerne af CNOT7 i egyptiske kvindelige BC-patienters kohorte i forhold til de klinisk-patologiske parametre. CNOT7-vævsekspression i BC-vævsprøver kategoriseret som metastatisk vs ikke-metastatisk tumor sammen med tilstødende ikke-tumorvævsmargin blev målt. Yderligere kvantificerede den inhiberende receptor på NK-celler, nemlig; LAIR-1 serumniveauer, hvis overekspression ville være forbundet med de aggressive BC-træk og ugunstige kliniske resultater (22) manifesteret som TNM. Korrelationen af ​​CNOT7 med LAIR-1-blodniveauer, der skal vurderes klinisk og skal bekræftes eller udrulles via bioinformatikdatabasesøgning og i silico-analyse. Ifølge efterforskerne leder efter BC-metastasemekanisme, ikke kun efter at udforske CNOT7- eller LAIR1-blodniveauer, og derfor finde flere terapeutiske muligheder via CNOT7 molekylær docking eller gennem blokering af dets downstream-veje eller effektor-gen-gen-netværks interaktion, enten som potentielt lovende behandlingsmuligheder. Hvor vil disse veje og interaktioner blive hentet fra KEGG-stisøgning, yderligere adresseret gennem tekstminerede interaktioner eller søgning i kuraterede i silico bioinformatik DB'er.

2.1. Studiedeltagere 2.1.1. Etisk godkendelse og informeret samtykke til at deltage. Etisk godkendelse blev opnået fra Ain Shams University, Det Farmaceutiske Fakultets revisionsudvalg Research Ethical Committee (REC ID# 48, 20. oktober 2021).

2.1.2. Undersøgelsen blev udført i henhold til retningslinjer fra World Medical Association (WMA), der opfylder Helsinki-deklarationens etiske principper for medicinsk forskning, der involverer mennesker, den reviderede juli 2018-version, hvor alle deltagende personer underskrev det etisk godkendte informerede samtykke (IC).

2.1.3. BC Patientgrupper. 90 kvindelige BC-patienter, frivillige i undersøgelsen, diagnosticeret med enten primær naiv (ikke-metastatisk) invasiv BC (46 patienter) eller metastatisk BC (44 patienter). Patienter blev tilfældigt indskrevet fra den kliniske onkologiske afdeling, det medicinske fakultet, Mansoura University Hospitals, Mansoura University, Mansoura, Egypten, efter at have underskrevet IC.

2.1.4. BC-diagnose blev udført med mammografi og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI). Fuld historie blev indsamlet og registreret for alle undersøgelsesdeltagere (n = 90).

Blodprøver og vævsparaffinblokkene blev indsamlet for dem, der opfyldte inklusionskriterierne og underskrev IC.

2.1.5. Patienters kliniske og patologiske træk. For alle BC-deltagere blev hele familiens sygdoms-/kræfthistorie registreret, såvel som patienternes diabetesstatus (ja vs nej), antal graviditeter (enten mindre eller mere end 2), menopausal status (før- vs post-) og modtagne behandling(er) (neoadjuverende kemoterapi, adjuverende kemoterapi, endokrin behandling eller mastektomi). Patienternes individuelle aktuelle kræftstatus og den kliniske tumorvurdering, udført på det medicinske fakultet, Mansoura University Hospital, Mansoura University, ved hjælp af tumor-node-metastasis (TNM) kategorisering i henhold til den 8. udgave af American Joint Committee on Cancer ( AJCC) iscenesættelsesmanual og Bloom-Richardson-skalaen for histologisk gradering (24) indsamlet fra patienters datafiler, efter at en biopsi blev taget på tidspunktet for BC kirurgisk udforskning/undersøgelse.

Immunhistokemi (IHC) resultater for proliferationsindekset Ki-67 (der enten er lavt eller højt), østrogenreceptor (ER), progesteronreceptor (PR) status og den humane epidermale vækstreceptor 2 (HER2/neu) (hver enten positiv eller negativ), kropsmasseindeks (BMI) kg/m2 (normal, overvægtig og fede 18,5-24,9, henholdsvis 25-29,9 og ≥30 kg/m2) (25), lymfeknude (LN) status (ingen N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) og alder i år blev alle indsamlet fra patientjournaler og tabuleret til statistisk analyse.

Molekylær BC-subtype (27), hvis luminal-lignende (ER+ og/eller PR+), HER-2-overekspression (ER-, PR-, HER-2+) eller triple-negativ BC (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) og histologiske BC-undertyper (28), hvis invasivt duktalt karcinom (IDC) eller ej, blev alle registreret til korrelationsanalyse.

3. Metoder 3.1. Biokemisk analyse 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA CNOT7 blev vurderet under anvendelse af Human CCR4 NOT transkriptionskompleks underenhed 7 (CNOT7) ELISA Kit, Mybiosource, USA, efter producentens instruktioner. Kort sagt blev standarderne og serumprøverne af både ikke-metastatiske BC- og metastatiske BC-grupper inkuberet sammen med CNOT7-HRP-konjugat i en anti-CNOT7-antistof præ-coated ELISA-plade leveret af producenten i en time ved 37°C. Efter inkubationsperioden blev brøndene dekanteret og vasket fem gange manuelt under anvendelse af en forfortyndet vaskebuffer leveret af producenten. Brønde inkuberet med et substrat for HRP-enzym i en time ved 37°C. Til sidst blev en stopopløsning tilsat for at standse reaktionen. Den producerede farveintensitet blev målt spektrofotometrisk ved 450 nm i en mikropladelæser. En standardkurve blev plottet, der relaterer farveintensiteten (Optical Density (O.D.)) til koncentrationen af ​​standarder. CNOT7-koncentrationen i hver prøve blev interpoleret fra denne standardkurve (supplerende fil).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 blev vurderet under anvendelse af Human LAIR-1 ELISA Kit, Mybiosource, USA. Standarder og prøver blev pipetteret i brøndene på en ELISA-plade præcoatet med et LAIR-1-specifikt antistof leveret af producenten. Pladen blev derefter dækket og inkuberet ved 37°C i 45 min. efterfulgt af et 5 gange manuel vasketrin under anvendelse af vaskebuffer, der tidligere var fortyndet. Et HRP-konjugeret detektionsantistof blev tilsat til pladen, og det blev inkuberet igen ved den samme temperatur i 30 min. Bagefter blev pladen vasket som forklaret tidligere og inkuberet med chromogenopløsninger i 15 min. efterfulgt af et sidste trin med tilsætning af stopopløsning. Farveintensiteten blev målt spektrofotometrisk ved 450 nm i en mikropladelæser. En standardkurve er plottet, der relaterer intensiteten af ​​farven (O.D.) til koncentrationen af ​​standarder. LAIR-1-koncentrationen i hver prøve blev interpoleret fra denne standardkurve (supplerende fil). Standarder blev fremstillet ud fra en stamopløsning og et standardfortyndingsmiddel leveret af producenten, der producerede en 2-folds fortyndingsserie 3.1.1.3. s.Insulin ELISA Seruminsulinanalyse blev udført under anvendelse af Hyperion Inc., Miami, FL, USA ELISA-kit. Testprøvens farveintensitet er direkte omvendt relateret til dens insulinkoncentration. Det normale insulinniveau for voksne er 0-25 mU/L.

3.1.2. Immunhistokemi 3.1.2.1. CNOT7 IHC-farvningsprotokol Brug af paraffinsektioner monteret på positivt ladede objektglas ved brug af avidin-biotin-peroxidasekompleks (ABC) teknik (29). Sektioner fra hver gruppe blev behandlet med CNOT7 (M01) (ABNOVA, kat. nr. H00029883-M01, monoklonalt antistof, klon 2F6) ved 1:25 fortynding, før de blev udsat for de kemikalier, der er nødvendige for ABC-metoden (Vectastain ABC-HRP kit, Vector laboratorier). For at påvise antigen-antistofkomplekser blev markørekspression mærket med peroxidase og farvet med diaminobenzidin (DAB, fremstillet af Sigma). Negative kontroller blev inkluderet under anvendelse af ikke-immunserum i stedet for de primære eller sekundære antistoffer. Leica-mikroskop (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Schweiz) blev brugt til at evaluere IHC-farvede snit (Leica Microsystems, Schweiz).

3.1.2.2. Kvantitativ evaluering af CNOT7 IHC-resultater "Areal %" I hver seriel sektion af de analyserede patientgrupper blev seks højeffektfelter (x 400) med positiv brun immunfarvning valgt til undersøgelse. Areal% af CNOT7-farvede sektioner blev beregnet ved hjælp af Leica QWin 500 billedanalysator-computersystemet (UK). Denne billedanalysator omfattede et Leica-mikroskop, et farvet videokamera, en farvet skærm og en harddisk fra en Leica IBM-personlig computer, der var forbundet med mikroskopet og administreret af Leica QWin 500-software.

Areal%-data blev statistisk rapporteret i form af middelværdi og standardafvigelse af middelværdi (gennemsnit ± S.E.M) for otte billeder fra fire ikke-metastatiske prøver og fire metastatiske prøver.

3.2. In silico Bioinformatik Analyse 3.2.1. Breast cancer Gene Expression Miner v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Opdateret den 28. juni 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) for at udforske sammenhængen mellem CNOT7 og LAIR1.

3.2.2. Funktionsmodul i LinkedOmics bruges til at udføre analyse af Gene Ontology biologiske proces (GO_BP) med gensæt berigelse analyse (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Gen-gen-interaktioner og -veje fra in silico-kurerede DB'er og tekstmining Via Genome Browser for målgener ved hjælp af University of California Santa Cruiz (UCSC) (32) Genomics institute http://genome.ucsc.edu/index.html LAIR1- og CNOT7-generinteraktioner blev hentet, med omtale af kendte hæmmerlægemidler fra DrugBank.

3.2.4. Protein-Protein Interaction (PPI) fra Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) database version 11.5 https://string-db.org/ som forudsiger interaktioner baseret på relevante eksperimentelle data, sekventeringsresultater og litteratur fra >1100 fuldt sekventeret organisme (33). Tilgået den 20. januar 2023 for at udforske LAIR-1 interagerende proteiner.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Udforskning af genekspressionsmønstre på tværs af normalt og tumorvæv (GENT2) med overlevelse http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Molekylær docking: 3.3.1. Forberedelse af proteinstrukturerne i LAIR-1 og CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Fra proteindatabanken (PDB) https:// www.rcsb.org/search krystalstrukturen af ​​Human LAIR-1 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Efter indlæsning af strukturerne i molekylært driftsmiljø (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Integreret computerstøttet molekylært designplatform, de blev forberedt ved hjælp af standardparametrene i 'QuickPrep Panel', herunder fjernelse af vandmolekyler, tilføjelse af brintatomer til proteinstrukturen, justering af protonationstilstande og sikring af energiminimering af proteinstrukturerne med Amber10 :EHT kraftfelt.

Da disse krystalstrukturer ikke blev co-krystalliseret med nogen ligander, MOE SiteFinder, blev et program til bindingsstedsanalyse udstyret i MOE'et brugt til at forudsige de mulige bindingssteder. Disse lommer er rangeret baseret på deres tilbøjelighed til ligandbinding (PLB). CNOT7 er en receptor uden tilgængelig PDB co-krystalliseret struktur, derfor brugte efterforskerne MOE siteFinder værktøjet til at hjælpe i vores undersøgelse, hvor guiden fra tidligere litteratur rapporterede om adskillige essentielle aminosyrerester involveret i ligand-CNOT7 protein interaktioner som Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) er blevet identificeret som relativt signifikante.

3.3.2. Liganddatasætkurering 'builderprogrammet' implementeret i MOE blev brugt til at modellere seks ligander i undersøgelsen; Vitamin E, Colchicin, Prodigiosin, Riboflavin, Telmisartan og Pioglitazon, hvor alle mulige konformationer ved den fysiologiske pH blev opnået.

3.3.3. Dockingsimuleringer Docking af de opnåede konformationer af de seks ligander blev udført ved anvendelse af placerings- og forfiningsalgoritmer af MOE-programmet. Indledende docking af molekylerne i de aktive steder brugte 'Triangle Matcher'-placeringsmetoden og 'London dG'-scoringsfunktionen. Yderligere finpudsning efter placering af docking-stillinger blev opnået ved at bruge 'GBVI/WSA dG'-scoringsmetoden. Poseringerne med minimal energi blev brugt til visualisering af bindingsinteraktionerne samt besættelse af receptorernes bindingssted.

3.4. Statistisk analyse 3.4.1. De indsamlede data blev registreret og analyseret ved hjælp af softwaren Statistical Package for Social Science (SPSS, Version 17, Chicago, IL, USA).

3.4.2. Kvalitative data blev præsenteret som frekvenser (n) og procenter (%). 3.4.3. Test for kvantitativ datanormalitet blev udført ved hjælp af Shapiro-Wilk-beregneren. Normalt fordelte variabler blev repræsenteret som middel ± S.E.M og analyseret ved hjælp af to prøver uafhængige Studenters t-test til sammenligning af to grupper. Ikke normalfordelte data blev præsenteret som medianer (interkvartilintervaller som første til tredje kvartil eller 25.-75. kvartil) og analyseret ved hjælp af Mann-Whitney (U) testen.

3.4.4. ROC-kurve blev udført for at detektere de bedste afskæringspunkter for at kategorisere CNOT7- og LAIR-1-serumniveauer i lav- og højekspressionsundergrupper.

3.4.5. Chi-square-testen blev brugt til at evaluere sammenhængen mellem CNOT7 serumniveauer og klinisk patologiske parametre. Pearson korrelationstest blev brugt til at vurdere sammenhængen mellem parametriske variabler. Punkt-biserielle korrelationer blev brugt til at bestemme korrelationen mellem parametre, når en af ​​dem var en dikotom variabel.

3.4.6. Signifikansniveauet blev sat til P<0,05 og konfidensniveau (C.I) eller interval til henholdsvis 95 % og 5 %.