胎盤の発達と機能に対する結核感染の影響

背景：

結核（TB）は世界的に妊産婦の罹患率と死亡率の重要な原因となっており、低所得国で最も負担が大きい。 ヨーロッパの登録ベースの研究では、妊娠は結核疾患の発生率増加と関連しており、妊娠が結核感染症（TBI）の進行を促進する可能性があることが示唆されています。 エチオピアの主要都市アダマに住む妊婦のコホートでは、参加者の3分の1が外傷性脳損傷を患っていた。 しかし、このコホートにおける妊娠中および産後の追跡調査中の結核疾患の発生率は比較的低かった（4年間の追跡調査中に参加者2000人中8例）。 興味深いことに、Mtb によって引き起こされる炎症誘発性サイトカインのレベルは妊娠後期に上昇しており、外傷性脳損傷女性では妊娠中の細菌活動の増加が示唆されています。 さらに、外傷性脳損傷を患っている妊婦の非特異的全身性炎症マーカーは、外傷性脳損傷を患っていない妊婦と比べて高かった。 これらの現象はどちらも、妊娠による結核制御の免疫修飾によるものである可能性があります。

妊娠中のこれらの免疫変化の影響については、十分に研究されていません。 結核症への進行リスクの増加とは別に、妊婦の外傷性脳損傷は、特に妊娠の転帰に関して、他の健康への悪影響を与える可能性があります。 結核流行国出身のスウェーデンに住む女性を対象とした最近の登録ベースの研究では、出産前ケアで外傷性脳損傷のスクリーニングを受け、外傷性脳損傷が数種類の有害な妊娠転帰と関連していることが判明した。 この発見は、外傷性脳損傷が胎盤の発達と機能に影響を及ぼし、したがって妊娠の合併症の一因となる可能性があることを示唆しています。 妊娠結果に対する母体感染の悪影響には、胎児および/または胎盤組織への直接感染や、胎盤の発育や機能に影響を与える全身性炎症を介した間接的な影響など、いくつかのメカニズムが関与している可能性があります。

このプロジェクトは、エチオピアの公立病院で出産した女性のコホートに基づいた、外傷性脳損傷と結核疾患および胎盤病理との関連性に関する詳細な研究です。 全体的な目的は、結核感染症および結核症の女性における胎盤の病理と胎盤機能不全のマーカーを、Mtb 免疫応答およびマイコバクテリア活性のマーカーおよび妊娠障害の特徴との相関関係とともに調査することです。

プロジェクトの説明 参加者は募集され、エチオピアのアディスアベバにある 2 つの公立紹介病院の分娩病棟に登録されます。 研究手順は、研究看護師と研究スタッフ、およびそれぞれの研究施設に拠点を置く訓練を受けた正規スタッフによって実行されます。 学習手続きは主に平日の昼間に行われます。

研究データは納品前と納品後に取得されます。 研究参加者からの情報は、電子構造化質問票を使用して収集されます。これには、社会人口統計学的状態、病歴および産科歴（現在および過去の妊娠）に関する質問のほか、Global Preparation Collaboration COLLECT データベースが推奨するその他の変数に関する質問が含まれます。 母子の身体状態（体重、身長、中上腕周囲径、アプガースコア）や分娩内容などの詳細なデータが登録されます。 研究データは、REDCAP サーバーに接続されたタブレットを使用して入力およびアップロードされます。 研究目的の血液サンプルは出産前に分娩棟で採取されます。 退院前に、女性は研究に関する詳細情報を得るために研究スタッフから再度連絡を受けます。 この時点で、参加者には 6 週間のフォローアップ訪問の予定日と研究チームの連絡先の詳細も届きます。

結核疾患を示唆する症状または徴候がある女性は、細菌学的結核検査のために朝の喀痰サンプルを 2 回提出するよう求められます。 肺外結核が疑われる女性には他の検査も行われる（症状の種類に応じて、例えば、末梢リンパ節腫脹の場合には細針吸引）。

胎盤全体は、研究病理学スタッフによって出産後 30 分以内に処理されます。 まず、アムステルダム胎盤ワークショップグループの推奨に基づく研究プロトコルに従って、胎盤を物理的および肉眼的に特徴付けます。 その後、胎盤はホルマリンで保存され、その後、組織病理学的検査のために選択された部分がパラフィンに包埋されます。 さらに、（TASH研究施設で出産した未分娩の妊娠をした女性から）胎盤組織の一部がRNAおよびタンパク質の発現分析および電子顕微鏡検査のために採取されます。 これらの部分をドライアイスで凍結し、続いて-80℃に移す。分娩直後、RNAトランスクリプトームプロファイルに関するその後の研究のために、臍帯血をEDTAチューブ(2～4ml)に採取する。

静脈血は、その後の QuantiFERON TB-Plus (QFT) 検査のためにリチウム ヘパリン チューブ (6 ml) に収集されます。 さらに、血液は EDTA チューブ (抗体分析用、4 ～ 6 ml) に採取されます。

外傷性脳損傷の状態を分類するための QFT 分析は、出産後 1 週間以内に実行されます。 結果は、6週間後のフォローアップ訪問時に参加者に通知されます。 無症候性結核を検出するために、外傷性脳損傷の女性は、この診察に関連して（症状に関係なく）胸部 X 線検査を受けるよう紹介されます。 また、上記の細菌学的結核分析のために、朝の喀痰サンプルを 2 つ提出するよう求められます。

分娩病棟入院時に得られる定期検査の結果が収集されます（HIV、マラリア、梅毒、糖尿病、腎機能、肝機能、血球数）。

実験方法

Mtb抗原を培養した血液:

血液はリチウム ヘパリン チューブに収集され、培養のために QFT チューブに分離されます。 インキュベーション後、血液を遠心分離して細胞ペレットから上清を分離します。 QFT ELISA はメーカーの推奨に従って実行されます。 残りの上清はアリコートに分けて保存し、RNA 安定剤の添加後に細胞ペレットを分離して保存します。 Mtb でインキュベートした細胞ペレットは、TBI および TB 疾患の選択された女性からの RNA 発現の配列ベースの分析に使用され、結核感染症の女性と結核疾患の女性（QFT 陰性対照を含む）のパターンを比較することによってマイコバクテリアの活性パターンを分析します。 ）。 Mtb でインキュベートした上清は、Luminex 技術プラットフォームを使用して、結核活性に関連するサイトカインについて分析されます (妊娠中の結核の免疫動態に関する以前の研究のデータに基づいています)。

未培養の血液:

静脈血は、Mtb 特異的抗体の分析のために EDTA チューブに採取されます。

胎盤：

胎盤組織の一部は、胎盤の肉眼的に正常な部分のさまざまな部分から取得されます。 一部は、組織病理学的 (ホルマリン) およびその他の研究 (冷凍保存用) の両方のために取得されます。 すべての部分には個別のコードが付けられます。

特定の研究目的のための方法:

1. 結核感染/結核疾患のある女性と持たない女性の胎盤の組織病理学を比較する。

   この目的のために、パラフィン包埋胎盤の切片がさまざまな種類の病理学的変化について分析されます。 さらに、電子顕微鏡検査は参加者の一部から実施されます。 試験官は、参加者の外傷性脳損傷の状態やその他の特徴について知らされません。 組織病理学的変化がスコア付けされます。 続いて、外傷性脳損傷の状態に関する比較が実行され、病理学的変化の発生がこれらのカテゴリー間で異なるかどうかが判断され、関連する付随条件が調整されます。

2. 結核感染/結核疾患のある女性と持たない女性の胎盤組織におけるRNA発現パターンを比較し、これらの所見を妊娠障害および胎盤機能不全に関連するパターンと相関させること。

   この目的のために、結核感染症/結核疾患の有無にかかわらず、また、あらかじめ定められた妊娠合併症 (子癇前症、子宮内発育制限) の有無にかかわらず女性の胎盤組織における RNA 発現パターンが分析されます。 この研究目的の参加者は、結核の感染/疾患の状態に基づいて全コホートから選択されます。 分娩による影響を避けるために、選択的CSの参加者のみがこの分析に含まれます（未分娩胎盤）。

   バルクシークエンシングは、RNA トランスクリプトミクスの分析に使用されます。 差次的に発現される遺伝子のパターンは、結核感染症/結核疾患の女性からの差次的に発現される遺伝子が(研究集団および文献からの)妊娠障害のある女性の遺伝子とどのように相関するかについてのバイオインフォマティクス分析を用いて、これらのカテゴリーで決定されます。 これらのパターンは、個々の妊娠転帰 (有害転帰、出生体重偏差) とも比較されます。

3. 外傷性脳損傷の有無にかかわらず、妊婦の胎盤組織におけるタンパク質発現を分析し、これらのパターンを胎盤の病理と相関させること。

   この目的のために、未分娩の胎盤組織の部分におけるタンパク質発現パターンを、結核感染/疾患状態に関して特徴付けることになる。 分析は質量分析法を使用して行われます。 発見されたタンパク質発現パターンは、その後、胎盤の病理および妊娠結果の特徴と相関することになります。

4. 外傷性脳損傷女性の胎盤組織におけるMtbの存在を確認する。 この目的のために、結核感染症/結核疾患のある参加者が (QFT 結果が陰性の多数の対照とともに) 含まれます。 胎盤組織の一部は、免疫組織化学/in situ ハイブリダイゼーション技術や、パラフィン化組織サンプルで使用するために開発された Mtb 特異的プローブなど、Mtb の存在を判定する方法で調査されます。

5. 結核感染/結核疾患の有無にかかわらず、妊婦の胎盤組織における免疫細胞の表現型を比較し、これらのパターンを胎盤の病理と相関させること。

   この目的のために、パラフィン包埋胎盤組織を使用して、外傷性脳損傷状態に関する女性の免疫細胞の表現型を特定します。 この目的のために免疫組織化学法が実施されます。

6. 結核感染/結核疾患の女性のMtb抗原刺激血液中のMtb特異的サイトカイン分泌およびRNA発現パターンを分析して、妊娠中にさまざまな種類の結核活動性を示す女性グループを描写し、これらのパターンを胎盤所見と相関させること。

   この目的のために、TBI の女性は、TB 活動を反映する免疫プロファイルに関して特徴付けられます。 これらの研究は、Mtb 特異的サイトカインの分析に Luminex 技術を使用して、Mtb でインキュベートした上清と細胞ペレットに基づいて行われます。 RNA発現パターンは、選択された参加者（外傷性脳損傷の女性、結核疾患の女性、およびQFT陰性の女性）からのシーケンスを使用して解析され、その後、より多くの結核感染/結核疾患の女性およびQFT陰性の女性からの差次的に発現される遺伝子を標的とするqPCRが行われます。 （さまざまな種類の結核感染症、初期疾患および無症状疾患に罹患している女性を特定するため）。 胎盤の機能と発達に影響を与える可能性のある他の要因を調整して、胎盤の所見をこれらのグループ間で比較します。

7. 外傷性脳損傷の妊婦のリンパ球上清中の結核特異的抗体を分析して、マイコバクテリアの活性と結核の病期を特徴づける この目的のために、外傷性脳損傷女性の培養 PBMC から得た上清中の BCG 特異的抗体を分析します。 PBMC は、細胞調製チューブを使用し、適合した培地で培養して単離されます。 培養上清をBCG特異的抗体の存在について分析し、これらのパターンを参加者間で比較して、活動性結核または初期結核に関して女性のサブセットを区別します（臨床的結核疾患を有する女性とQFT陰性対照のパターンの比較を伴う）。 。