结核感染对胎盘发育和功能的影响

背景：

结核病（TB）是全球孕产妇发病和死亡的重要原因，低收入国家的负担最高。 欧洲的登记研究表明，怀孕与结核病发病率增加有关，表明怀孕可以促进结核病感染（TBI）的进展。 在埃塞俄比亚主要城市阿达玛的一组孕妇中，三分之一的参与者患有创伤性脑损伤。 然而，该队列在怀孕期间和产后随访期间结核病的发病率相对较低（在 4 年随访期间，2000 名参与者中有 8 例）。 有趣的是，Mtb 触发的促炎细胞因子水平在怀孕后期升高，表明患有 TBI 的女性在怀孕期间细菌活性增加。 此外，与没有 TBI 的孕妇相比，患有 TBI 的孕妇的非特异性全身炎症标志物更高。 这两种现象很可能是由于妊娠引起的结核病控制免疫改变所致。

怀孕期间这些免疫变化的后果尚未得到广泛研究。 除了增加发展为结核病的风险外，孕妇的创伤性脑损伤还可能对健康产生其他不利影响，特别是在妊娠结局方面。 最近一项针对来自结核病流行国家的居住在瑞典的妇女进行的一项登记研究显示，TBI 与多种类型的不良妊娠结局相关。 这一发现表明，TBI 可能会影响胎盘的发育和功能，从而可能导致妊娠并发症。 母体感染对妊娠结局的不利影响可能涉及多种机制，包括胎儿和/或胎盘组织的直接感染，以及全身炎症介导的间接影响，影响胎盘发育和功能。

该项目是一项针对 TBI 与结核病和胎盘病理学之间关联的深入研究，以埃塞俄比亚公立医院分娩的一组妇女为基础。 总体目标是调查结核感染和结核病女性的胎盘病理学和胎盘功能障碍标志物，与结核分枝杆菌免疫反应和分枝杆菌活性标志物以及妊娠性疾病特征的相关性。

项目描述 参与者将在埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴的两家公立转诊医院的产房进行招募和登记。 研究程序将由研究护士和研究人员以及各自研究中心经过培训的正式工作人员执行。 学习程序主要在工作日的白天进行。

研究数据将在分娩前和分娩后获得。 将使用电子结构化问卷收集研究参与者的信息，包括有关社会人口状况、医疗和产科史（当前和既往怀孕）以及全球妊娠合作 COLLECT 数据库推荐的其他变量的问题。 将记录母婴身体状况的详细数据（体重、身高、中上臂围、阿普加评分）以及分娩详情。 研究数据将使用连接到 REDCAP 服务器的平板电脑输入和上传。 用于研究目的的血液样本将在分娩前在产房采集。 在出院之前，研究人员将再次联系女性以获取有关该研究的更多信息。 此时，参与者还将收到 6 周随访的预定日期，以及研究团队的联系方式。

有结核病症状或体征的妇女将被要求提交两份早晨痰样本，以进行细菌学结核病调查。 将对疑似肺外结核的女性进行其他检查（取决于表现类型；例如，在周围淋巴结肿大的情况下进行细针抽吸）。

整个胎盘将在分娩后 30 分钟内由研究病理学人员进行处理。 首先，将按照基于阿姆斯特丹胎盘研讨会小组建议的研究方案对胎盘进行物理和宏观表征。 然后将胎盘储存在福尔马林中，随后将选定的部分包埋在石蜡中以进行组织病理学研究。 此外（来自在 TASH 研究地点分娩的未临产妊娠妇女），还将获取部分胎盘组织用于 RNA 和蛋白质表达分析以及电子显微镜检查。 这些部分将被冷冻在干冰上，随后转移至-80°C。分娩后，将立即将脐带血收集在EDTA管（2-4ml）中，用于随后的RNA转录组谱研究。

静脉血将被收集在肝素锂管 (6 ml) 中，用于随后的 QuantiFERON TB-Plus (QFT) 测试。 此外，血液将收集在 EDTA 管中（用于抗体分析；4-6 ml）。

TBI 状态分类的 QFT 分析将在分娩后一周内进行。 结果将在 6 周随访时告知参与者。 为了发现亚临床结核病，患有 TBI 的女性将在本次就诊时接受胸部 X 光检查（无论症状如何）。 如上所述，他们还将被要求提交两份早晨痰样本以进行细菌学结核病分析。

将收集入院时获得的常规检查结果（艾滋病毒、疟疾、梅毒、糖尿病、肾功能、肝功能、血细胞计数）。

实验室方法

Mtb 抗原孵育的血液：

将血液收集在肝素锂管中，并分离到 QFT 管中进行孵育。 孵育后，将血液离心以将上清液与细胞沉淀分离。 QFT ELISA 将根据制造商的建议进行。 剩余的上清液将分装保存，细胞沉淀将在添加 RNA 稳定剂后分离并保存。 Mtb 孵育的细胞沉淀将用于对选定的患有 TBI 和 TB 疾病的女性进行基于序列的 RNA 表达分析，通过比较感染 TB 的女性和患有 TB 疾病的女性（包括 QFT 阴性对照）的模式来分析分枝杆菌活性模式）。 使用 Luminex 技术平台，将分析结核分枝杆菌孵育的上清液中与结核病活动相关的细胞因子（基于之前关于妊娠期间结核病免疫动态的研究数据）。

未孵化的血液：

将在 EDTA 管中获取静脉血，用于分析 Mtb 特异性抗体。

胎盘：

胎盘组织的部分将从胎盘的宏观正常部分的不同部分获得。 将获得部分用于组织病理学（福尔马林）和其他研究（用于冷冻储存）。 所有部分都将标有单独的代码。

针对特定研究目标的方法：

1. 比较患有和未患有结核病感染/疾病的女性的胎盘组织病理学。

   为此，将对石蜡包埋胎盘切片进行不同类型的病理变化分析。 此外，将对一部分参与者进行电子显微镜检查。 考官将不了解 TBI 状态和参与者的其他特征。 对组织病理学变化进行评分。 随后，将进行TBI状态的比较，以确定这些类别之间病理变化的发生是否不同，并根据相关伴随条件进行调整。

2. 比较患有和未患有结核感染/疾病的女性胎盘组织中的 RNA 表达模式，并将这些发现与妊娠疾病和胎盘功能障碍相关的模式联系起来。

   为此，将对患有和不患有结核感染/疾病的女性以及患有和不患有预先确​​定的妊娠并发症（先兆子痫、子宫内生长受限）的女性的胎盘组织中的RNA表达模式进行分析。 本研究的参与者将根据结核病感染/疾病状况从总队列中选出。 为了避免临产的影响，只有选择性 CS 的参与者才会被纳入本分析（未临产胎盘）。

   批量测序将用于 RNA 转录组学分析。 将确定这些类别中差异表达基因的模式，通过生物信息学分析患有结核病感染/疾病的女性的差异表达基因与患有妊娠疾病的女性的差异表达基因（来自研究人群和文献）的相关性。 这些模式还将与个体妊娠结果（不良结果、出生体重偏差）进行比较。

3. 分析患有和未患有 TBI 的孕妇胎盘组织中的蛋白质表达，并将这些模式与胎盘病理学相关联。

   为此，将根据结核病感染/疾病状态来表征未分娩胎盘组织部分中的蛋白质表达模式。 将使用质谱法进行分析。 随后发现的蛋白质表达模式将与胎盘病理学和妊娠结局特征相关。

4. 确定患有 TBI 的女性胎盘组织中是否存在 Mtb。 为此，将包括患有结核病感染/疾病的参与者（以及一些 QFT 结果为阴性的对照）。 将使用确定 Mtb 存在的方法对部分胎盘组织进行研究，包括免疫组织化学/原位杂交技术以及已开发用于石蜡组织样本的 Mtb 特异性探针。

5. 比较有和没有结核感染/疾病的孕妇胎盘组织中的免疫细胞表型，并将这些模式与胎盘病理学相关联。

   为此，石蜡包埋的胎盘组织将用于识别女性 TBI 状态的免疫细胞表型。 为此目的将进行免疫组织化学方法。

6. 分析患有结核病感染/患病的女性结核分枝杆菌抗原刺激的血液中结核分枝杆菌特异性细胞因子的分泌和 RNA 表达模式，以描绘怀孕期间具有不同类型结核病活动的女性群体，并将这些模式与胎盘检查结果相关联。

   为此，将对患有 TBI 的女性进行反映 TB 活动的免疫特征的表征。 这些研究将基于 Mtb 孵育的上清液和细胞沉淀，使用 Luminex 技术分析 Mtb 特异性细胞因子。 将使用选定参与者（TBI 女性、结核病女性和 QFT 阴性女性）的测序来分析 RNA 表达模式，然后针对大量结核感染/疾病女性和 QFT 阴性女性的差异表达基因进行 qPCR （为了识别患有不同类型结核病感染、初期和亚临床疾病的女性）。 将比较这些组之间的胎盘检查结果，并调整可能影响胎盘功能和发育的其他因素。

7. 分析患有 TBI 的孕妇淋巴细胞上清液中的结核病特异性抗体，以表征分枝杆菌活性和结核病阶段。为此，将对来自 TBI 妇女的培养 PBMC 上清液中的 BCG 特异性抗体进行分析。 将使用细胞制备管分离 PBMC，并在适应的培养基上培养。 将分析培养物上清液中是否存在 BCG 特异性抗体，并将在参与者之间比较这些模式，以区分活动性或初期结核病女性亚群（比较患有临床结核病的女性和 QFT 阴性对照的模式） 。