Efectos de la infección por tuberculosis sobre el desarrollo y la función de la placenta

Fondo:

La tuberculosis (TB) es una causa importante de morbilidad y mortalidad materna a nivel mundial, con la carga más alta en los países de bajos ingresos. El embarazo se ha asociado con una mayor incidencia de la enfermedad de tuberculosis en estudios basados ​​en registros realizados en Europa, lo que sugiere que el embarazo puede promover la progresión de la infección de tuberculosis (TBI). En una cohorte de mujeres embarazadas que vivían en Adama, una importante ciudad etíope, un tercio de las participantes padecía una lesión cerebral traumática. Sin embargo, la incidencia de la enfermedad de tuberculosis durante el embarazo y el seguimiento posparto en esta cohorte fue relativamente baja (8 casos entre 2000 participantes durante 4 años de seguimiento). Curiosamente, los niveles de citoquinas proinflamatorias activadas por Mtb se elevaron durante las últimas etapas del embarazo, lo que sugiere una mayor actividad bacteriana durante el embarazo en mujeres con TBI. Además, los marcadores de inflamación sistémica no específicos en mujeres embarazadas con TCE fueron más altos en comparación con las mujeres embarazadas sin TCE. Es probable que ambos fenómenos se deban a una modificación inmunitaria del control de la tuberculosis inducida por el embarazo.

Las consecuencias de estos cambios inmunitarios durante el embarazo no se han estudiado exhaustivamente. Además del mayor riesgo de progresión a la enfermedad de tuberculosis, es posible que la TBI en mujeres embarazadas pueda tener otros efectos adversos para la salud, en particular con respecto al resultado del embarazo. En un estudio reciente basado en registros de mujeres que viven en Suecia y son originarias de países endémicos de tuberculosis sometidas a pruebas de detección de TBI en la atención prenatal, se encontró que la TBI estaba asociada con varios tipos de resultados adversos del embarazo. Este hallazgo sugiere que la TBI podría afectar el desarrollo y la función de la placenta y, por lo tanto, podría contribuir a las complicaciones del embarazo. Varios mecanismos pueden estar involucrados en los efectos adversos de la infección materna sobre el resultado del embarazo, incluida la infección directa del tejido fetal y/o placentario, así como efectos indirectos mediados por la inflamación sistémica con impacto en el desarrollo y la función de la placenta.

Este proyecto es un estudio en profundidad sobre las asociaciones entre TBI y tuberculosis y patología placentaria, basado en una cohorte de mujeres que dieron a luz en hospitales públicos de Etiopía. El objetivo general es investigar la patología placentaria y los marcadores de disfunción placentaria en mujeres con infección y enfermedad de tuberculosis, con correlación con las respuestas inmunes de Mtb y los marcadores de actividad micobacteriana y con las características de los trastornos del embarazo.

Descripción del proyecto Los participantes serán reclutados e inscritos en salas de parto en dos hospitales públicos de referencia en Addis Abeba, Etiopía. Los procedimientos del estudio serán realizados por enfermeras de investigación y personal de investigación, así como por personal regular capacitado en los respectivos sitios de estudio. Los procedimientos del estudio se llevarán a cabo principalmente durante el día durante los días de semana.

Los datos del estudio se obtendrán antes y después del parto. La información de los participantes del estudio se recopilará mediante cuestionarios electrónicos estructurados, que incluyen preguntas sobre condición sociodemográfica, historial médico y obstétrico (embarazos actuales y anteriores), así como otras variables recomendadas por la base de datos COLLECT de Global Embarazo Collaboration. Se registrarán datos detallados sobre el estado físico de la madre y del bebé (peso, altura, circunferencia de la parte media del brazo, puntuación de Apgar), así como los detalles del parto. Los datos del estudio se ingresarán y cargarán mediante tabletas conectadas a un servidor REDCAP. Se obtendrán muestras de sangre para fines de investigación en la sala de partos antes del parto. Antes del alta hospitalaria, el personal del estudio se comunicará nuevamente con las mujeres para obtener más información sobre el estudio. En este momento, los participantes también recibirán una fecha programada para la visita de seguimiento de 6 semanas, así como los datos de contacto del equipo del estudio.

A las mujeres con síntomas o signos que sugieran la enfermedad de tuberculosis se les pedirá que presenten dos muestras de esputo por la mañana para investigaciones bacteriológicas de tuberculosis. Se realizarán otras investigaciones en mujeres con sospecha de tuberculosis extrapulmonar (según el tipo de presentación; por ejemplo, aspiración con aguja fina en caso de linfadenopatía periférica).

El personal de patología del estudio se ocupará de toda la placenta dentro de los 30 minutos posteriores al parto. En primer lugar, la placenta se caracterizará física y macroscópicamente siguiendo un protocolo de estudio basado en las recomendaciones del Amsterdam Placental Workshop Group. Luego, la placenta se almacenará en formalina y luego las partes seleccionadas se incluirán en parafina para investigaciones histopatológicas. Además (de mujeres con embarazos sin parto que dan a luz en el sitio del estudio TASH), se obtendrán porciones de tejido de placenta para análisis de expresión de ARN y proteínas, así como para microscopía electrónica. Estas porciones se congelarán en hielo seco, con posterior transferencia a -80 ° C. Inmediatamente después del parto, la sangre del cordón umbilical se recolectará en tubos con EDTA (2-4 ml) para estudios posteriores sobre el perfil transcriptómico del ARN.

La sangre venosa se recolectará en tubos de heparina de litio (6 ml) para pruebas posteriores QuantiFERON TB-Plus (QFT). Además, la sangre se recogerá en tubos con EDTA (para análisis de anticuerpos; 4-6 ml).

El análisis QFT para la categorización del estado de TBI se realizará dentro de una semana después del parto. El resultado se comunicará a los participantes en la visita de seguimiento de 6 semanas. Para detectar tuberculosis subclínica, las mujeres con TBI serán remitidas a una radiografía de tórax (independientemente de los síntomas) en relación con esta visita. También se les pedirá que envíen dos muestras de esputo por la mañana para análisis bacteriológicos de tuberculosis como se describe anteriormente.

Se recopilarán los resultados de las pruebas de rutina obtenidas al ingreso a la sala de partos (VIH, malaria, sífilis, diabetes, función renal, función hepática, hemograma).

Métodos de laboratorio

Sangre incubada con antígeno Mtb:

La sangre se recolectará en tubos de heparina de litio y se separará en tubos QFT para su incubación. Después de la incubación, la sangre se centrifugará para separar el sobrenadante del sedimento celular. QFT ELISA se realizará según la recomendación del fabricante. Los sobrenadantes restantes se almacenarán en alícuotas y los sedimentos celulares se separarán y almacenarán después de la adición del estabilizador de ARN. El sedimento celular incubado con Mtb se utilizará para el análisis basado en secuencias de la expresión de ARN de mujeres seleccionadas con TBI y enfermedad de tuberculosis para analizar patrones de actividad micobacteriana mediante comparación de patrones en mujeres con infección de tuberculosis y aquellas con enfermedad de tuberculosis (incluidos los controles negativos de QFT). ). Los sobrenadantes incubados con Mtb se analizarán en busca de citoquinas relacionadas con la actividad de la tuberculosis (según datos de estudios previos sobre la dinámica inmune de la tuberculosis durante el embarazo), utilizando plataformas tecnológicas Luminex.

Sangre no incubada:

La sangre venosa se obtendrá en tubos con EDTA para el análisis de anticuerpos específicos de Mtb.

Placenta:

Se obtendrán porciones de tejido placentario de diferentes partes de partes macroscópicamente normales de la placenta. Se obtendrán porciones tanto para estudios histopatológicos (formalina) como de otro tipo (para almacenamiento en congelador). Todas las porciones estarán etiquetadas con códigos individuales.

Métodos para objetivos de estudio específicos:

1. Comparar la histopatología placentaria en mujeres con y sin infección/enfermedad de tuberculosis.

   Para ello, se analizarán secciones de placenta incluida en parafina para detectar diferentes tipos de cambios patológicos. Además, se realizará microscopía electrónica a un subconjunto de participantes. Los examinadores estarán cegados al estado de TBI y otras características de los participantes. Se puntuarán los cambios histopatológicos. Posteriormente, se realizará una comparación con respecto al estado de TBI para determinar si la aparición de cambios patológicos difiere entre estas categorías, con ajuste por condiciones concomitantes relevantes.

2. Comparar los patrones de expresión de ARN en el tejido de la placenta en mujeres con y sin infección/enfermedad de tuberculosis, y correlacionar estos hallazgos con patrones asociados con trastornos del embarazo y disfunción placentaria.

   Para ello, se analizarán los patrones de expresión de ARN en tejido placentario de mujeres con y sin infección/enfermedad de tuberculosis, así como de mujeres con y sin complicaciones predefinidas del embarazo (preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino). Los participantes para el objetivo de este estudio serán seleccionados de la cohorte total, según el estado de infección/enfermedad de tuberculosis. Para evitar efectos del trabajo de parto, solo se incluirán en este análisis participantes con CS electiva (placenta no laborada).

   La secuenciación masiva se utilizará para el análisis de la transcriptómica de ARN. Los patrones de genes expresados ​​diferencialmente se determinarán en estas categorías, con análisis bioinformático sobre cómo los genes expresados ​​diferencialmente de mujeres con infección/enfermedad de tuberculosis se correlacionan con los de mujeres con trastornos del embarazo (de la población de estudio y de la literatura). Estos patrones también se compararán con los resultados individuales del embarazo (resultado adverso, desviaciones del peso al nacer).

3. Analizar la expresión de proteínas en el tejido de la placenta en mujeres embarazadas con y sin TCE y correlacionar estos patrones con la patología placentaria.

   Para este objetivo, se caracterizarán los patrones de expresión de proteínas en porciones de tejido placentario no trabajado con respecto al estado de infección/enfermedad de tuberculosis. El análisis se realizará mediante espectrometría de masas. Los patrones de expresión de proteínas encontrados se correlacionarán posteriormente con la patología placentaria y con las características del resultado del embarazo.

4. Determinar la presencia de Mtb en tejido placentario en mujeres con TCE. Para este objetivo, se incluirán participantes con infección/enfermedad de tuberculosis (junto con una serie de controles con resultados QFT negativos). Se investigarán porciones de tejido placentario con métodos para determinar la presencia de Mtb, incluidas técnicas de histoquímica inmune/hibridación in situ, y sondas específicas de Mtb que se han desarrollado para su uso en muestras de tejido parafinado.

5. Comparar los fenotipos de las células inmunitarias en el tejido placentario en mujeres embarazadas con y sin infección/enfermedad de tuberculosis, y correlacionar estos patrones con la patología placentaria.

   Para este objetivo, se utilizará tejido de placenta incluido en parafina para identificar fenotipos de células inmunes en mujeres con respecto al estado de TBI. Para ello se realizarán métodos de inmunohistoquímica.

6. Analizar la secreción de citocinas específicas de Mtb y los patrones de expresión de ARN en sangre estimulada por antígeno de Mtb en mujeres con infección/enfermedad de tuberculosis para delimitar grupos de mujeres con diferentes tipos de actividad de tuberculosis durante el embarazo y correlacionar estos patrones con hallazgos placentarios.

   Para este objetivo, las mujeres con TBI se caracterizarán con respecto a perfiles inmunológicos que reflejan la actividad de la tuberculosis. Estas investigaciones se basarán en sobrenadantes y sedimentos celulares incubados con Mtb, utilizando técnicas Luminex para el análisis de citocinas específicas de Mtb. Los patrones de expresión de ARN se analizarán mediante secuenciación de participantes seleccionadas (mujeres con TBI, mujeres con enfermedad de tuberculosis y mujeres con QFT negativo), seguido de qPCR dirigida a genes expresados ​​diferencialmente de un mayor número de mujeres con infección/enfermedad de tuberculosis y mujeres con QFT negativo. (con el fin de identificar mujeres con diferentes tipos de infección por TB, enfermedad incipiente y subclínica). Los hallazgos placentarios se compararán entre estos grupos, con ajustes por otros factores que pueden afectar la función y el desarrollo de la placenta.

7. Analizar anticuerpos específicos de tuberculosis en sobrenadantes de linfocitos en mujeres embarazadas con TBI para caracterizar la actividad micobacteriana y el estadio de la enfermedad de tuberculosis. Para este objetivo, se analizarán anticuerpos específicos de BCG en sobrenadantes de PBMC cultivadas de mujeres con TBI. Las PBMC se aislarán utilizando tubos de preparación celular, con cultivo en medios adaptados. Los sobrenadantes de los cultivos se analizarán para detectar la presencia de anticuerpos específicos de BCG y estos patrones se compararán entre los participantes para distinguir subconjuntos de mujeres con respecto a la tuberculosis activa o incipiente (con comparación de patrones en mujeres con enfermedad de tuberculosis clínica y controles negativos para QFT) .