Virkninger af tuberkuloseinfektion på udvikling og funktion af placenta

Baggrund:

Tuberkulose (TB) er en vigtig årsag til mødresygelighed og -dødelighed globalt, med den højeste byrde i lavindkomstlande. Graviditet er blevet forbundet med øget forekomst af TB-sygdom i registerbaserede undersøgelser fra Europa, hvilket tyder på, at graviditet kan fremme progression af TB-infektion (TBI). I en kohorte af gravide kvinder, der bor i Adama, en større etiopisk by, havde en tredjedel af deltagerne TBI. Alligevel var forekomsten af ​​TB-sygdom under graviditet og post-partum opfølgning i denne kohorte relativt lav (8 tilfælde blandt 2000 deltagere i løbet af 4 års opfølgning). Interessant nok var niveauer af Mtb-udløste pro-inflammatoriske cytokiner forhøjet under senere stadier af graviditeten, hvilket tyder på øget bakteriel aktivitet under graviditet hos kvinder med TBI. Derudover var ikke-specifikke systemiske inflammationsmarkører hos gravide kvinder med TBI højere sammenlignet med gravide kvinder uden TBI. Det er sandsynligt, at begge disse fænomener skyldes graviditetsinduceret immunmodifikation af TB-kontrol.

Konsekvenserne af disse immunforandringer i graviditeten er ikke blevet grundigt undersøgt. Ud over øget risiko for progression til TB-sygdom er det muligt, at TBI hos gravide kvinder kan have andre negative helbredseffekter, især med hensyn til graviditetsresultatet. I en nylig registerbaseret undersøgelse af kvinder, der bor i Sverige med oprindelse i TB-endemiske lande, screenet for TBI i svangerskabsomsorgen, blev TBI fundet at være forbundet med flere typer af ugunstige graviditetsudfald. Dette fund tyder på, at TBI kan påvirke udviklingen og funktion af moderkagen og dermed kunne bidrage til graviditetskomplikationer. Adskillige mekanismer kan være involveret i uønskede virkninger af moderinfektion på graviditetsresultatet, herunder direkte infektion af føtalt og/eller placentavæv, såvel som indirekte effekter medieret af systemisk inflammation med indvirkning på placenta udvikling og funktion.

Dette projekt er en dybdegående undersøgelse af sammenhængen mellem TBI og TB sygdom og placenta patologi, baseret på en kohorte af kvinder med fødsel på etiopiske offentlige hospitaler. Det overordnede mål er at undersøge placenta patologi og markører for placental dysfunktion hos kvinder med TB-infektion og TB-sygdom, med korrelation til Mtb-immunresponser og markører for mykobakteriel aktivitet og til karakteristika ved graviditetsforstyrrelser.

Projektbeskrivelse Deltagerne vil blive rekrutteret og indskrevet på fødeafdelinger på to offentlige henvisningshospitaler i Addis Abeba, Etiopien. Studieprocedurer vil blive udført af forskningssygeplejersker og forskningspersonale samt af uddannet almindeligt personale baseret på de respektive studiesteder. Studieprocedurer vil hovedsageligt blive gennemført i dagtimerne på hverdage.

Undersøgelsesdata vil blive indhentet før såvel som efter levering. Oplysninger fra studiedeltagere vil blive indsamlet ved hjælp af elektroniske strukturerede spørgeskemaer, herunder spørgsmål om sociodemografisk tilstand, medicinsk og obstetrisk historie (nuværende og tidligere graviditeter), samt andre variabler anbefalet af Global Pregnancy Collaboration COLLECT-databasen. Detaljerede data om moderens og spædbarnets fysiske status (vægt, højde, midterste overarmsomkreds, Apgar-score) samt leveringsdetaljer vil blive registreret. Undersøgelsesdata vil blive indtastet og uploadet ved hjælp af tablets forbundet til en REDCAP-server. Blodprøver til forskningsformål vil blive udtaget på fødeafdelingen inden fødslen. Inden udskrivelsen fra hospitalet vil kvinder igen blive kontaktet af undersøgelsens personale for yderligere information om undersøgelsen. På dette tidspunkt vil deltagerne også modtage en planlagt dato for det 6 ugers opfølgningsbesøg samt kontaktoplysninger til studieholdet.

Kvinder med symptomer eller tegn, der tyder på TB-sygdom, vil blive bedt om at indsende to morgensputumprøver til bakteriologisk TB-undersøgelser. Andre undersøgelser vil blive udført hos kvinder med mistanke om ekstrapulmonal TB (afhængigt af præsentationstypen; f.eks. finnålsaspiration i tilfælde af perifer lymfadenopati).

Hele moderkagen vil blive taget hånd om inden for 30 minutter efter fødslen af ​​undersøgelsens patologipersonale. Først vil placenta blive karakteriseret fysisk og makroskopisk efter en undersøgelsesprotokol baseret på anbefalingerne fra Amsterdam Placental Workshop Group. Placenta vil derefter blive opbevaret i formalin, med senere indlejring af udvalgte dele i paraffin til histopatologiske undersøgelser. Derudover (fra kvinder med uarbejdet graviditet, som føder på TASH-undersøgelsesstedet), vil der blive opnået portioner af placentavæv til RNA- og proteinekspressionsanalyser samt til elektronmikroskopi. Disse portioner vil blive frosset på tøris, med efterfølgende overførsel til -80°C. Direkte efter levering vil navlestrengsblod blive opsamlet i EDTA-rør (2-4 ml) til efterfølgende undersøgelser af RNA-transkriptomisk profil.

Venøst ​​blod vil blive opsamlet i lithium heparinrør (6 ml) til efterfølgende QuantiFERON TB-Plus (QFT) test. Derudover vil der blive opsamlet blod i EDTA-rør (til antistofanalyser; 4-6 ml).

QFT-analyse til kategorisering af TBI-status vil blive udført inden for en uge efter levering. Resultatet vil blive kommunikeret til deltagerne ved det 6 ugers opfølgningsbesøg. For at påvise subklinisk TB vil kvinder med TBI blive henvist til røntgen af ​​thorax (uanset symptomer) i forbindelse med dette besøg. De vil også blive bedt om at indsende to morgensputumprøver til bakteriologiske TB-analyser som beskrevet ovenfor.

Resultater fra rutineundersøgelser opnået ved indlæggelse på fødeafdelingen vil blive indsamlet (HIV, malaria, syfilis, diabetes, nyrefunktion, leverfunktion, blodtal).

Laboratoriemetoder

Mtb antigen-inkuberet blod:

Blod vil blive opsamlet i lithium heparin rør og adskilt i QFT rør til inkubation. Efter inkubation vil blod blive centrifugeret for at adskille supernatanten fra cellepelleten. QFT ELISA vil blive udført i henhold til producentens anbefaling. Resterende supernatanter vil blive opbevaret i alikvoter, og cellepelleter vil blive adskilt og opbevaret efter tilsætning af RNA-stabilisator. Den Mtb-inkuberede cellepellet vil blive brugt til sekvensbaseret analyse af RNA-ekspression fra udvalgte kvinder med TBI og TB-sygdom for at analysere mycobakterielle aktivitetsmønstre ved sammenligning af mønstre hos kvinder med TB-infektion og dem med TB-sygdom (herunder QFT-negative kontroller ). Mtb-inkuberede supernatanter vil blive analyseret for cytokiner forbundet med TB-aktivitet (baseret på data fra tidligere undersøgelser af TB-immundynamik under graviditet) ved hjælp af Luminex teknologiplatforme.

Ikke-inkuberet blod:

Venøst ​​blod vil blive opnået i EDTA-rør til analyse af Mtb-specifikke antistoffer.

Moderkage:

Dele af placentavæv vil blive hentet fra forskellige dele af makroskopisk normale dele af placenta. Portioner vil blive opnået både til histopatologiske (formalin) og andre undersøgelser (til fryseopbevaring). Alle portioner vil blive mærket med individuelle koder.

Metoder til specifikke studiemål:

1. At sammenligne placenta histopatologi hos kvinder med og uden TB infektion/sygdom.

   Til dette formål vil sektioner af paraffinindlejret placenta blive analyseret for forskellige typer patologiske forandringer. Derudover vil der blive udført elektronmikroskopi fra en undergruppe af deltagere. Eksaminatorer vil blive blindet for TBI-status og andre karakteristika hos deltagerne. De histopatologiske ændringer vil blive bedømt. Efterfølgende vil der blive foretaget sammenligning med hensyn til TBI-status for at afgøre, om forekomsten af ​​patologiske forandringer er forskellig mellem disse kategorier, med justering for relevante samtidige tilstande.

2. At sammenligne RNA-ekspressionsmønstre i placentavæv hos kvinder med og uden TB-infektion/sygdom og at korrelere disse fund med mønstre forbundet med graviditetsforstyrrelser og placental dysfunktion.

   Til dette formål vil RNA-ekspressionsmønstre blive analyseret i placentavæv fra kvinder med og uden TB-infektion/-sygdom, samt fra kvinder med og uden foruddefinerede graviditetskomplikationer (præeklampsi, intra-uterin vækstrestriktion). Deltagerne til dette studiemål vil blive udvalgt fra den samlede kohorte baseret på TB-infektion/sygdomsstatus. For at undgå virkninger fra fødslen vil kun deltagere med elektiv CS blive inkluderet i denne analyse (uarbejdet placenta).

   Bulk-sekventering vil blive brugt til analyse af RNA-transkriptomik. Mønstre af differentielt udtrykte gener vil blive bestemt i disse kategorier, med bioinformatisk analyse af, hvordan differentielt udtrykte gener fra kvinder med TB-infektion/sygdom korrelerer med gener hos kvinder med graviditetsforstyrrelser (fra undersøgelsespopulationen og fra litteratur). Disse mønstre vil også blive sammenlignet med individuelle graviditetsudfald (uønsket resultat, fødselsvægtafvigelser).

3. At analysere proteinekspression i placentavæv hos gravide kvinder med og uden TBI, og at korrelere disse mønstre med placental patologi.

   Til dette formål vil proteinekspressionsmønstre i dele af ubearbejdet placentavæv blive karakteriseret med hensyn til TB-infektion/sygdomsstatus. Analyse vil blive udført ved hjælp af massespektrometri. De fundne proteinekspressionsmønstre vil efterfølgende være korreleret til placenta patologi og til graviditetsresultatkarakteristika.

4. For at bestemme tilstedeværelsen af ​​Mtb i placentavæv hos kvinder med TBI. Til dette formål vil deltagere med TB-infektion/-sygdom blive inkluderet (sammen med en række kontroller med negative QFT-resultater). Dele af placentavæv vil blive undersøgt med metoder til at bestemme tilstedeværelsen af ​​Mtb, herunder immunhistokemi/in-situ hybridiseringsteknikker og Mtb-specifikke prober, der er udviklet til brug i paraffiniserede vævsprøver.

5. At sammenligne immuncellefænotyper i placentavæv hos gravide kvinder med og uden TB infektion/sygdom, og at korrelere disse mønstre med placenta patologi.

   Til dette formål vil paraffinindlejret placentavæv blive brugt til at identificere immuncellefænotyper hos kvinder med hensyn til TBI-status. Immunhistokemiske metoder vil blive udført til dette formål.

6. At analysere Mtb-specifik cytokin-sekretion og RNA-ekspressionsmønstre i Mtb-antigen-stimuleret blod hos kvinder med TB-infektion/-sygdom for at afgrænse grupper af kvinder med forskellige typer af TB-aktivitet under graviditet, og at korrelere disse mønstre med placentafund.

   Til dette formål vil kvinder med TBI blive karakteriseret med hensyn til immunprofiler, der afspejler TB-aktivitet. Disse undersøgelser vil være baseret på Mtb-inkuberede supernatanter og cellepelleter, ved brug af Luminex-teknikker til analyse af Mtb-specifikke cytokiner. RNA-ekspressionsmønstre vil blive analyseret ved hjælp af sekventering fra udvalgte deltagere (kvinder med TBI, kvinder med TB-sygdom og QFT-negative kvinder), efterfulgt af qPCR rettet mod differentielt udtrykte gener fra et større antal kvinder med TB-infektion/-sygdom og QFT-negative kvinder (for at identificere kvinder med forskellige typer TB-infektion, begyndende og subklinisk sygdom). Placentafundene vil blive sammenlignet mellem disse grupper, med justering for andre faktorer, der kan påvirke placentafunktion og udvikling.

7. At analysere TB-specifikke antistoffer i lymfocyt-supernatanter hos gravide kvinder med TBI for at karakterisere mycobakteriel aktivitet og TB-sygdomsstadium. Til dette formål vil BCG-specifikke antistoffer blive analyseret i supernatanter fra dyrkede PBMC'er fra kvinder med TBI. PBMC'er vil blive isoleret ved hjælp af celleforberedelsesrør med dyrkning på tilpassede medier. Kultursupernatanter vil blive analyseret for tilstedeværelse af BCG-specifikke antistoffer, og disse mønstre vil blive sammenlignet mellem deltagere for at skelne undergrupper af kvinder med hensyn til aktiv eller begyndende TB (med sammenligning af mønstre hos kvinder med klinisk TB-sygdom og QFT-negative kontroller) .