Effekter av tuberkuloseinfeksjon på utvikling og funksjon av placenta

Bakgrunn:

Tuberkulose (TB) er en viktig årsak til mødresykelighet og -dødelighet globalt, med den høyeste belastningen i lavinntektsland. Graviditet har vært assosiert med økt forekomst av TB-sykdom i registerbaserte studier fra Europa, noe som tyder på at graviditet kan fremme progresjon av TB-infeksjon (TBI). I en gruppe gravide kvinner som bor i Adama, en storby i Etiopien, hadde en tredjedel av deltakerne TBI. Likevel var forekomsten av TB-sykdom under graviditet og postpartum oppfølging i denne kohorten relativt lav (8 tilfeller blant 2000 deltakere i løpet av 4 års oppfølging). Interessant nok ble nivåer av Mtb-utløste pro-inflammatoriske cytokiner forhøyet under senere stadier av svangerskapet, noe som tyder på økt bakteriell aktivitet under graviditet hos kvinner med TBI. I tillegg var ikke-spesifikke systemiske betennelsesmarkører hos gravide kvinner med TBI høyere sammenlignet med gravide uten TBI. Det er sannsynlig at begge disse fenomenene skyldes graviditetsindusert immunmodifikasjon av TB-kontroll.

Konsekvensene av disse immunforandringene i svangerskapet har ikke blitt grundig studert. Bortsett fra økt risiko for progresjon til TB-sykdom, er det mulig at TBI hos gravide kan ha andre uheldige helseeffekter, spesielt med tanke på graviditetsutfall. I en nylig registerbasert studie av kvinner bosatt i Sverige med opprinnelse i TB-endemiske land screenet for TBI i svangerskapsomsorg, ble TBI funnet å være assosiert med flere typer uønskede graviditetsutfall. Dette funnet tyder på at TBI kan påvirke utviklingen og funksjonen til morkaken, og kan dermed bidra til graviditetskomplikasjoner. Flere mekanismer kan være involvert i uønskede effekter av morsinfeksjon på graviditetsutfallet, inkludert direkte infeksjon av foster- og/eller placentavev, samt indirekte effekter mediert av systemisk inflammasjon med innvirkning på placentautvikling og funksjon.

Dette prosjektet er en dybdestudie på assosiasjonene mellom TBI og TB-sykdom og placentapatologi, basert på en kohort av kvinner med fødsel ved etiopiske offentlige sykehus. Det overordnede målet er å undersøke placentapatologi og markører for placental dysfunksjon hos kvinner med TB-infeksjon og TB-sykdom, med korrelasjon til Mtb-immunresponser og markører for mykobakteriell aktivitet og til karakteristika ved svangerskapsforstyrrelser.

Prosjektbeskrivelse Deltakerne vil bli rekruttert og innskrevet ved fødselsavdelinger ved to offentlige henvisningssykehus i Addis Abeba, Etiopia. Studieprosedyrer vil bli utført av forskningssykepleiere og forskningspersonell, samt av utdannet fast personale basert på de respektive studiestedene. Studieprosedyrer vil i hovedsak gjennomføres på dagtid på ukedager.

Studiedata vil innhentes før og etter levering. Informasjon fra studiedeltakere vil bli samlet inn ved hjelp av elektroniske strukturerte spørreskjemaer, inkludert spørsmål om sosiodemografisk tilstand, medisinsk og obstetrisk historie (nåværende og tidligere svangerskap), samt andre variabler anbefalt av Global Pregnancy Collaboration COLLECT-databasen. Detaljerte data om mors og spedbarns fysiske status (vekt, høyde, midt-overarmsomkrets, Apgar-score), samt leveringsdetaljer, vil bli registrert. Studiedata vil bli lagt inn og lastet opp ved hjelp av nettbrett koblet til en REDCAP-server. Blodprøver til forskningsformål vil bli innhentet på fødeavdelingen før fødsel. Før utskrivning fra sykehus vil kvinner igjen bli kontaktet av studiepersonell for ytterligere informasjon om studien. På dette tidspunktet vil deltakerne også motta en planlagt dato for 6 ukers oppfølgingsbesøk, samt kontaktinformasjon for studieteamet.

Kvinner med symptomer eller tegn som tyder på TB-sykdom vil bli bedt om å sende inn to morgensputumprøver for bakteriologisk TB-undersøkelse. Andre undersøkelser vil bli utført hos kvinner med mistanke om ekstrapulmonal tuberkulose (avhengig av type presentasjon; for eksempel finnålsaspirasjon ved perifer lymfadenopati).

Hele morkaken vil bli tatt hånd om innen 30 minutter etter fødsel av studiepatologipersonell. Først vil placenta bli karakterisert fysisk og makroskopisk etter en studieprotokoll basert på anbefalingene fra Amsterdam Placental Workshop Group. Morkaken vil deretter lagres i formalin, med senere innstøping av utvalgte deler i parafin for histopatologiske undersøkelser. I tillegg (fra kvinner med uarbeidet graviditet som føder på TASH-studiestedet), vil porsjoner av morkakevev bli innhentet for RNA- og proteinekspresjonsanalyser, samt for elektronmikroskopi. Disse porsjonene vil bli frosset på tørris, med påfølgende overføring til -80°C. Rett etter levering vil navlestrengsblod samles i EDTA-rør (2-4 ml) for påfølgende studier på RNA-transkriptomisk profil.

Venøst ​​blod vil bli samlet i litiumheparinrør (6 ml) for påfølgende QuantiFERON TB-Plus (QFT) testing. I tillegg vil det bli tatt opp blod i EDTA-rør (for antistoffanalyser; 4-6 ml).

QFT-analyse for kategorisering av TBI-status vil bli utført innen en uke etter levering. Resultatet vil bli formidlet til deltakerne ved 6 ukers oppfølgingsbesøk. For å avdekke subklinisk TB vil kvinner med TBI bli henvist til røntgen thorax (uavhengig av symptomer) i forbindelse med dette besøket. De vil også bli bedt om å levere to morgensputumprøver for bakteriologiske TB-analyser som beskrevet ovenfor.

Resultater fra rutineprøver innhentet ved fødselsavdeling vil bli samlet inn (HIV, malaria, syfilis, diabetes, nyrefunksjon, leverfunksjon, blodtall).

Laboratoriemetoder

Mtb antigen-inkubert blod:

Blod vil bli samlet i litiumheparinrør og separert i QFT-rør for inkubering. Etter inkubering vil blod bli sentrifugert for å skille supernatanten fra cellepelleten. QFT ELISA vil bli utført i henhold til produsentens anbefaling. Gjenværende supernatanter vil bli lagret i alikvoter, og cellepelleter vil bli separert og lagret etter tilsetning av RNA-stabilisator. Den Mtb-inkuberte cellepelleten vil bli brukt til sekvensbasert analyse av RNA-ekspresjon fra utvalgte kvinner med TBI og TB-sykdom for å analysere mykobakterielle aktivitetsmønstre ved å sammenligne mønstre hos kvinner med TB-infeksjon og de med TB-sykdom (inkludert QFT-negative kontroller ). Mtb-inkuberte supernatanter vil bli analysert for cytokiner knyttet til TB-aktivitet (basert på data fra tidligere studier på TB-immundynamikk under graviditet), ved bruk av Luminex teknologiplattformer.

Uinkubert blod:

Venøst ​​blod vil bli innhentet i EDTA-rør for analyse av Mtb-spesifikke antistoffer.

Placenta:

Deler av morkakevev vil bli hentet fra ulike deler av makroskopisk normale deler av morkaken. Porsjoner vil bli innhentet både for histopatologiske (formalin) og andre studier (for fryselagring). Alle porsjoner blir merket med individuelle koder.

Metoder for spesifikke studiemål:

1. For å sammenligne placenta histopatologi hos kvinner med og uten tuberkuloseinfeksjon/sykdom.

   For dette formålet vil seksjoner av parafininnstøpt placenta bli analysert for ulike typer patologiske forandringer. I tillegg vil det bli utført elektronmikroskopi fra en undergruppe av deltakere. Eksaminatorer vil bli blindet for TBI-status og andre egenskaper ved deltakerne. De histopatologiske endringene vil bli skåret. Deretter vil sammenligning med hensyn til TBI-status bli utført for å avgjøre om forekomsten av patologiske forandringer er forskjellig mellom disse kategoriene, med justering for relevante samtidige tilstander.

2. Å sammenligne RNA-ekspresjonsmønstre i placentavev hos kvinner med og uten TB-infeksjon/sykdom, og å korrelere disse funnene med mønstre assosiert med svangerskapsforstyrrelser og placental dysfunksjon.

   For dette formålet vil RNA-ekspresjonsmønstre bli analysert i placentavev fra kvinner med og uten TB-infeksjon/sykdom, samt fra kvinner med og uten forhåndsdefinerte svangerskapskomplikasjoner (preeklampsi, intra-uterin vekstbegrensning). Deltakere for dette studiemålet vil bli valgt fra den totale kohorten, basert på TB-infeksjon/sykdomsstatus. For å unngå effekter fra fødsel vil kun deltakere med elektiv CS inkluderes i denne analysen (uarbeidet placenta).

   Bulksekvensering vil bli brukt for analyse av RNA-transkriptomikk. Mønstre av differensielt uttrykte gener vil bli bestemt i disse kategoriene, med bioinformatisk analyse av hvordan differensielt uttrykte gener fra kvinner med TB-infeksjon/sykdom korrelerer med de hos kvinner med svangerskapsforstyrrelser (fra studiepopulasjonen og fra litteratur). Disse mønstrene vil også bli sammenlignet med individuelle svangerskapsutfall (ugunstig utfall, fødselsvektavvik).

3. Å analysere proteinuttrykk i placentavev hos gravide kvinner med og uten TBI, og å korrelere disse mønstrene med placental patologi.

   For dette formålet vil proteinekspresjonsmønstre i deler av ubearbeidet placentavev karakteriseres med hensyn til TB-infeksjon/sykdomsstatus. Analyse vil bli gjort ved hjelp av massespektrometri. Proteinekspresjonsmønstrene som er funnet vil deretter være korrelert til placentapatologi og til svangerskapsresultatkarakteristika.

4. For å bestemme tilstedeværelsen av Mtb i placentavev hos kvinner med TBI. For dette formålet vil deltakere med tuberkuloseinfeksjon/-sykdom inkluderes (sammen med en rekke kontroller med negative QFT-resultater). Deler av placentavev vil bli undersøkt med metoder for å bestemme tilstedeværelse av Mtb, inkludert immunhistokjemi/in-situ hybridiseringsteknikker, og Mtb-spesifikke prober som er utviklet for bruk i parafiniserte vevsprøver.

5. Å sammenligne immuncellefenotyper i placentavev hos gravide kvinner med og uten TB-infeksjon/sykdom, og å korrelere disse mønstrene med placentapatologi.

   For dette formålet vil parafininnstøpt placentavev bli brukt til å identifisere immuncellefenotyper hos kvinner med hensyn til TBI-status. Immunhistokjemimetoder vil bli utført for dette formålet.

6. Å analysere Mtb-spesifikk cytokinsekresjon og RNA-ekspresjonsmønstre i Mtb-antigen-stimulert blod hos kvinner med TB-infeksjon/-sykdom for å avgrense grupper av kvinner med ulike typer TB-aktivitet under svangerskapet, og å korrelere disse mønstrene med placentale funn.

   For dette formålet vil kvinner med TBI karakteriseres med hensyn til immunprofiler som reflekterer TB-aktivitet. Disse undersøkelsene vil være basert på Mtb-inkuberte supernatanter og cellepelleter, ved bruk av Luminex-teknikker for analyse av Mtb-spesifikke cytokiner. RNA-ekspresjonsmønstre vil bli analysert ved bruk av sekvensering fra utvalgte deltakere (kvinner med TBI, kvinner med TB-sykdom og QFT-negative kvinner), etterfulgt av qPCR rettet mot differensielt uttrykte gener fra et større antall kvinner med TB-infeksjon/-sykdom og QFT-negative kvinner (for å identifisere kvinner med ulike typer tuberkuloseinfeksjon, begynnende og subklinisk sykdom). Morkakefunnene vil sammenlignes mellom disse gruppene, med justering for andre faktorer som kan påvirke morkakefunksjon og utvikling.

7. Å analysere TB-spesifikke antistoffer i lymfocyttsupernatanter hos gravide kvinner med TBI for å karakterisere mykobakteriell aktivitet og TB-sykdomsstadium. For dette formålet vil BCG-spesifikke antistoffer analyseres i supernatanter fra dyrkede PBMCer fra kvinner med TBI. PBMC-er vil bli isolert ved hjelp av celleforberedelsesrør, med kultur på tilpassede medier. Kultursupernatanter vil bli analysert for tilstedeværelse av BCG-spesifikke antistoffer, og disse mønstrene vil bli sammenlignet mellom deltakerne for å skille undergrupper av kvinner med hensyn til aktiv eller begynnende TB (med sammenligning av mønstre hos kvinner med klinisk TB-sykdom og QFT-negative kontroller) .