Effets de l'infection tuberculeuse sur le développement et la fonction du placenta

Arrière-plan:

La tuberculose (TB) est une cause importante de morbidité et de mortalité maternelles à l'échelle mondiale, le fardeau le plus lourd étant enregistré dans les pays à faible revenu. La grossesse a été associée à une incidence accrue de tuberculose dans des études basées sur des registres en Europe, ce qui suggère que la grossesse peut favoriser la progression de l'infection tuberculeuse (TCC). Dans une cohorte de femmes enceintes vivant à Adama, une grande ville éthiopienne, un tiers des participantes avaient un traumatisme crânien. Pourtant, l'incidence de la tuberculose pendant la grossesse et le suivi post-partum dans cette cohorte était relativement faible (8 cas parmi 2 000 participantes pendant 4 ans de suivi). Il est intéressant de noter que les niveaux de cytokines pro-inflammatoires déclenchées par le Mtb étaient élevés au cours des derniers stades de la grossesse, suggérant une activité bactérienne accrue pendant la grossesse chez les femmes atteintes de TBI. De plus, les marqueurs d’inflammation systémique non spécifiques chez les femmes enceintes atteintes de TBI étaient plus élevés que chez les femmes enceintes sans TBI. Il est probable que ces deux phénomènes soient dus à une modification immunitaire du contrôle de la tuberculose induite par la grossesse.

Les conséquences de ces changements immunitaires pendant la grossesse n’ont pas été étudiées de manière approfondie. Outre le risque accru de progression vers la tuberculose, il est possible que les traumatismes crâniens chez les femmes enceintes aient d'autres effets néfastes sur la santé, en particulier en ce qui concerne l'issue de la grossesse. Dans une récente étude basée sur des registres portant sur des femmes vivant en Suède et originaires de pays d'endémie tuberculeuse, dépistées pour un traumatisme crânien lors de soins prénatals, le traumatisme crânien s'est avéré associé à plusieurs types d'issues indésirables de la grossesse. Cette découverte suggère que le TBI pourrait affecter le développement et la fonction du placenta et pourrait ainsi contribuer aux complications de la grossesse. Plusieurs mécanismes peuvent être impliqués dans les effets indésirables de l’infection maternelle sur l’issue de la grossesse, notamment l’infection directe des tissus fœtaux et/ou placentaires, ainsi que les effets indirects médiés par l’inflammation systémique ayant un impact sur le développement et la fonction placentaire.

Ce projet est une étude approfondie sur les associations entre le TCC, la tuberculose et la pathologie placentaire, basée sur une cohorte de femmes ayant accouché dans des hôpitaux publics éthiopiens. L'objectif global est d'étudier la pathologie placentaire et les marqueurs de dysfonctionnement placentaire chez les femmes atteintes d'une infection tuberculeuse et d'une maladie tuberculeuse, avec une corrélation avec les réponses immunitaires du Mtb et les marqueurs de l'activité mycobactérienne et aux caractéristiques des troubles de la grossesse.

Description du projet Les participants seront recrutés et inscrits dans les salles de travail de deux hôpitaux publics de référence à Addis Abeba, en Éthiopie. Les procédures d'étude seront effectuées par des infirmières de recherche et du personnel de recherche, ainsi que par du personnel régulier formé basé sur les sites d'étude respectifs. Les procédures d'étude seront principalement menées pendant la journée en semaine.

Les données de l'étude seront obtenues avant et après l'accouchement. Les informations des participants à l'étude seront collectées à l'aide de questionnaires électroniques structurés, y compris des questions sur la condition sociodémographique, les antécédents médicaux et obstétricaux (grossesses actuelles et antérieures), ainsi que d'autres variables recommandées par la base de données Global Pregnancy Collaboration COLLECT. Des données détaillées sur l'état physique de la mère et du nourrisson (poids, taille, circonférence à mi-bras, score d'Apgar), ainsi que les détails de l'accouchement, seront enregistrés. Les données de l'étude seront saisies et téléchargées à l'aide de tablettes connectées à un serveur REDCAP. Des échantillons de sang à des fins de recherche seront prélevés en salle de travail avant l'accouchement. Avant leur sortie de l'hôpital, les femmes seront à nouveau contactées par le personnel de l'étude pour plus d'informations sur l'étude. À ce moment-là, les participants recevront également une date prévue pour la visite de suivi de 6 semaines, ainsi que les coordonnées de l'équipe d'étude.

Les femmes présentant des symptômes ou des signes évocateurs de la tuberculose seront invitées à soumettre deux échantillons d'expectorations le matin pour des investigations bactériologiques sur la tuberculose. D'autres investigations seront réalisées chez les femmes suspectées de tuberculose extrapulmonaire (en fonction du type de présentation ; par exemple, aspiration à l'aiguille fine en cas d'adénopathie périphérique).

L'ensemble du placenta sera pris en charge dans les 30 minutes suivant l'accouchement par le personnel de pathologie de l'étude. Tout d'abord, le placenta sera caractérisé physiquement et macroscopiquement selon un protocole d'étude basé sur les recommandations de l'Amsterdam Placental Workshop Group. Le placenta sera ensuite stocké dans du formol, avec inclusion ultérieure de parties sélectionnées dans de la paraffine pour les investigations histopathologiques. De plus (chez les femmes dont la grossesse n'a pas abouti et qui accouchent sur le site d'étude TASH), des portions de tissu placentaire seront obtenues pour les analyses d'expression de l'ARN et des protéines, ainsi que pour la microscopie électronique. Ces portions seront congelées sur de la neige carbonique, puis transférées à -80°C. Directement après l'accouchement, le sang de cordon sera collecté dans des tubes EDTA (2-4 ml) pour des études ultérieures sur le profil transcriptomique de l'ARN.

Le sang veineux sera collecté dans des tubes d'héparine de lithium (6 ml) pour des tests ultérieurs QuantiFERON TB-Plus (QFT). De plus, le sang sera collecté dans des tubes EDTA (pour les analyses d'anticorps ; 4-6 ml).

L'analyse QFT pour la catégorisation du statut TBI sera effectuée dans la semaine suivant l'accouchement. Le résultat sera communiqué aux participants lors de la visite de suivi de 6 semaines. Afin de détecter une tuberculose subclinique, les femmes atteintes de TCC seront référées pour une radiographie pulmonaire (indépendamment des symptômes) dans le cadre de cette visite. Il leur sera également demandé de soumettre deux échantillons d'expectorations matinaux pour les analyses bactériologiques de la tuberculose comme décrit ci-dessus.

Les résultats des tests de routine obtenus lors de l'admission en salle de travail seront collectés (VIH, paludisme, syphilis, diabète, fonction rénale, fonction hépatique, formule sanguine).

Méthodes de laboratoire

Sang incubé avec l'antigène Mtb :

Le sang sera collecté dans des tubes d'héparine de lithium et séparé dans des tubes QFT pour l'incubation. Après l'incubation, le sang sera centrifugé pour séparer le surnageant du culot cellulaire. QFT ELISA sera réalisé selon les recommandations du fabricant. Les surnageants restants seront stockés en aliquotes et les culots cellulaires seront séparés et stockés après l'ajout d'un stabilisateur d'ARN. Le culot cellulaire incubé par Mtb sera utilisé pour l'analyse basée sur la séquence de l'expression de l'ARN de femmes sélectionnées atteintes de TBI et de tuberculose afin d'analyser les modèles d'activité mycobactérienne par comparaison des modèles chez les femmes infectées par la tuberculose et celles atteintes de tuberculose (y compris les contrôles QFT négatifs ). Les surnageants incubés par Mtb seront analysés pour les cytokines liées à l'activité de la tuberculose (sur la base des données d'études antérieures sur la dynamique immunitaire de la tuberculose pendant la grossesse), à ​​l'aide des plateformes technologiques Luminex.

Sang non incubé :

Le sang veineux sera obtenu dans des tubes EDTA pour l'analyse des anticorps spécifiques du Mtb.

Placenta:

Des portions de tissu placentaire seront obtenues à partir de différentes parties de parties macroscopiquement normales du placenta. Des portions seront obtenues à la fois pour des études histopathologiques (formol) et autres (pour le stockage au congélateur). Toutes les portions seront étiquetées avec des codes individuels.

Méthodes pour des objectifs d’étude spécifiques :

1. Comparer l'histopathologie placentaire chez les femmes avec et sans infection/maladie tuberculeuse.

   Dans ce but, des coupes de placenta inclus en paraffine seront analysées pour différents types de changements pathologiques. De plus, la microscopie électronique sera réalisée auprès d'un sous-ensemble de participants. Les examinateurs ne connaîtront pas le statut TBI et d'autres caractéristiques des participants. Les changements histopathologiques seront notés. Par la suite, une comparaison en ce qui concerne le statut TBI sera effectuée pour déterminer si l'apparition de changements pathologiques diffère entre ces catégories, avec ajustement pour les conditions concomitantes pertinentes.

2. Comparer les modèles d'expression de l'ARN dans le tissu placentaire chez les femmes avec et sans infection/maladie tuberculeuse, et corréler ces résultats avec les modèles associés aux troubles de la grossesse et au dysfonctionnement placentaire.

   Dans ce but, les modèles d'expression de l'ARN seront analysés dans le tissu placentaire de femmes avec et sans infection/maladie tuberculeuse, ainsi que de femmes avec et sans complications de grossesse prédéfinies (pré-éclampsie, retard de croissance intra-utérin). Les participants à cet objectif d'étude seront sélectionnés dans la cohorte totale, en fonction du statut d'infection/maladie tuberculeuse. Afin d'éviter les effets du travail, seuls les participants avec CS élective seront inclus pour cette analyse (placenta sans travail).

   Le séquençage en masse sera utilisé pour l'analyse de la transcriptomique de l'ARN. Les modèles de gènes différentiellement exprimés seront déterminés dans ces catégories, avec une analyse bioinformatique sur la façon dont les gènes différentiellement exprimés chez les femmes atteintes d'une infection/maladie tuberculeuse sont en corrélation avec ceux des femmes souffrant de troubles de la grossesse (de la population étudiée et de la littérature). Ces modèles seront également comparés aux issues de grossesse individuelles (issues indésirables, écarts de poids à la naissance).

3. Analyser l'expression des protéines dans le tissu placentaire chez les femmes enceintes avec et sans TBI, et corréler ces modèles avec la pathologie placentaire.

   Dans ce but, les modèles d'expression des protéines dans des parties de tissu placentaire non travaillé seront caractérisés en ce qui concerne l'état d'infection/maladie tuberculeuse. L'analyse sera effectuée par spectrométrie de masse. Les modèles d'expression des protéines trouvés seront ensuite corrélés à la pathologie placentaire et aux caractéristiques de l'issue de la grossesse.

4. Déterminer la présence de Mtb dans le tissu placentaire chez les femmes atteintes de TBI. Pour cet objectif, les participants atteints d'une infection/maladie tuberculeuse seront inclus (avec un certain nombre de contrôles avec des résultats QFT négatifs). Des portions de tissu placentaire seront étudiées à l'aide de méthodes permettant de déterminer la présence de Mtb, y compris des techniques d'histochimie immunitaire/d'hybridation in situ et des sondes spécifiques à Mtb qui ont été développées pour être utilisées dans des échantillons de tissus paraffinés.

5. Comparer les phénotypes des cellules immunitaires dans le tissu placentaire chez les femmes enceintes avec et sans infection/maladie tuberculeuse, et corréler ces modèles avec la pathologie placentaire.

   Dans ce but, le tissu placentaire inclus en paraffine sera utilisé pour identifier les phénotypes de cellules immunitaires chez les femmes en ce qui concerne le statut TBI. Des méthodes d'immunohistochimie seront réalisées à cet effet.

6. Analyser la sécrétion de cytokines spécifiques au Mtb et les modèles d'expression de l'ARN dans le sang stimulé par l'antigène Mtb chez les femmes atteintes d'une infection/maladie tuberculeuse afin de délimiter les groupes de femmes présentant différents types d'activité tuberculeuse pendant la grossesse et de corréler ces modèles avec les résultats placentaires.

   Dans ce but, les femmes atteintes de TBI seront caractérisées en ce qui concerne les profils immunitaires reflétant l'activité de la tuberculose. Ces investigations seront basées sur des surnageants et des culots cellulaires incubés par Mtb, en utilisant les techniques Luminex pour l'analyse des cytokines spécifiques de Mtb. Les modèles d'expression de l'ARN seront analysés à l'aide du séquençage de participants sélectionnés (femmes atteintes de TCC, femmes atteintes de tuberculose et femmes QFT négatives), suivi d'une qPCR ciblant les gènes différentiellement exprimés d'un plus grand nombre de femmes atteintes d'une infection/maladie tuberculeuse et de femmes QFT négatives. (afin d'identifier les femmes présentant différents types d'infection tuberculeuse, de maladie naissante et subclinique). Les résultats placentaires seront comparés entre ces groupes, avec ajustement pour d'autres facteurs pouvant affecter la fonction et le développement placentaires.

7. Analyser les anticorps spécifiques de la tuberculose dans les surnageants de lymphocytes chez les femmes enceintes atteintes de TBI pour caractériser l'activité mycobactérienne et le stade de la tuberculose. Dans cet objectif, les anticorps spécifiques du BCG seront analysés dans les surnageants de PBMC en culture de femmes atteintes de TBI. Les PBMC seront isolées à l'aide de tubes de préparation cellulaire, avec culture sur milieux adaptés. Les surnageants de culture seront analysés pour détecter la présence d'anticorps spécifiques au BCG, et ces modèles seront comparés entre les participants pour distinguer les sous-ensembles de femmes en ce qui concerne la tuberculose active ou naissante (avec comparaison des modèles chez les femmes atteintes de tuberculose clinique et des contrôles QFT négatifs). .