Effetti dell'infezione da tubercolosi sullo sviluppo e sulla funzione della placenta

Sfondo:

La tubercolosi (TBC) è un’importante causa di morbilità e mortalità materna a livello globale, con il peso più elevato nei paesi a basso reddito. La gravidanza è stata associata ad un aumento dell’incidenza della malattia tubercolare negli studi europei basati su registri, suggerendo che la gravidanza può promuovere la progressione dell’infezione tubercolare (TBI). In un gruppo di donne incinte che vivevano ad Adama, una delle principali città etiopi, un terzo dei partecipanti aveva un trauma cranico. Tuttavia, l’incidenza della malattia tubercolare durante la gravidanza e il follow-up post-partum in questa coorte è stata relativamente bassa (8 casi su 2000 partecipanti durante 4 anni di follow-up). È interessante notare che i livelli di citochine proinfiammatorie innescate da Mtb erano elevati durante le fasi successive della gravidanza, suggerendo un aumento dell’attività batterica durante la gravidanza nelle donne con trauma cranico. Inoltre, i marcatori di infiammazione sistemica non specifici nelle donne in gravidanza con trauma cranico erano più alti rispetto alle donne in gravidanza senza trauma cranico. È probabile che entrambi questi fenomeni siano dovuti alla modificazione immunitaria del controllo della tubercolosi indotta dalla gravidanza.

Le conseguenze di questi cambiamenti immunitari in gravidanza non sono state ampiamente studiate. Oltre all’aumento del rischio di progressione verso la tubercolosi, è possibile che il trauma cranico nelle donne in gravidanza possa avere altri effetti avversi sulla salute, in particolare per quanto riguarda l’esito della gravidanza. In un recente studio basato su registri su donne residenti in Svezia originarie di paesi endemici per la tubercolosi, sottoposte a screening per il trauma cranico durante l'assistenza prenatale, il trauma cranico è risultato associato a diversi tipi di esiti avversi della gravidanza. Questa scoperta suggerisce che il trauma cranico potrebbe influenzare lo sviluppo e la funzione della placenta e potrebbe quindi contribuire alle complicazioni della gravidanza. Diversi meccanismi possono essere coinvolti negli effetti avversi dell’infezione materna sull’esito della gravidanza, inclusa l’infezione diretta del tessuto fetale e/o placentare, nonché effetti indiretti mediati dall’infiammazione sistemica con impatto sullo sviluppo e sulla funzione della placenta.

Questo progetto è uno studio approfondito sulle associazioni tra TBI e tubercolosi e patologia placentare, basato su una coorte di donne con parto presso ospedali pubblici etiopi. L'obiettivo generale è studiare la patologia placentare e i marcatori di disfunzione placentare nelle donne con infezione da tubercolosi e malattia tubercolare, con correlazione con le risposte immunitarie di Mtb e marcatori di attività micobatterica e con le caratteristiche dei disturbi della gravidanza.

Descrizione del progetto I partecipanti verranno reclutati e arruolati nei reparti travaglio di due ospedali pubblici di riferimento ad Addis Abeba, in Etiopia. Le procedure di studio saranno eseguite da infermieri di ricerca e personale di ricerca, nonché da personale regolare addestrato con sede nei rispettivi siti di studio. Le procedure di studio saranno condotte principalmente durante il giorno durante i giorni feriali.

I dati dello studio verranno ottenuti prima e dopo il parto. Le informazioni dei partecipanti allo studio verranno raccolte utilizzando questionari strutturati elettronici, comprese domande sulla condizione socio-demografica, sulla storia medica e ostetrica (gravidanze attuali e precedenti), nonché su altre variabili raccomandate dal database Global Pregnancy Collaboration COLLECT. Verranno registrati i dati dettagliati sullo stato fisico materno e infantile (peso, altezza, circonferenza del braccio medio-alta, punteggio di Apgar), nonché i dettagli del parto. I dati dello studio verranno inseriti e caricati utilizzando tablet collegati a un server REDCAP. I campioni di sangue a scopo di ricerca verranno prelevati in sala travaglio prima del parto. Prima della dimissione dall'ospedale, le donne verranno nuovamente contattate dal personale dello studio per ulteriori informazioni sullo studio. In questo momento, i partecipanti riceveranno anche una data programmata per la visita di follow-up di 6 settimane, nonché i dettagli di contatto per il team di studio.

Alle donne con sintomi o segni suggestivi di malattia tubercolare verrà chiesto di presentare due campioni di espettorato mattutino per indagini batteriologiche sulla tubercolosi. Altre indagini verranno eseguite in donne con sospetta tubercolosi extrapolmonare (a seconda del tipo di presentazione; ad esempio, agoaspirato in caso di linfoadenopatia periferica).

L'intera placenta verrà curata entro 30 minuti dal parto dal personale di patologia dello studio. Innanzitutto, la placenta sarà caratterizzata fisicamente e macroscopicamente seguendo un protocollo di studio basato sulle raccomandazioni dell'Amsterdam Placental Workshop Group. La placenta verrà poi conservata in formalina, con successiva inclusione delle parti selezionate in paraffina per le indagini istopatologiche. Inoltre (da donne con gravidanza non partorita che partoriscono nel sito di studio TASH), verranno ottenute porzioni di tessuto placentare per l'analisi dell'espressione di RNA e proteine, nonché per la microscopia elettronica. Tali porzioni verranno congelate in ghiaccio secco, con successivo trasferimento a -80° C. Subito dopo il parto, il sangue cordonale verrà raccolto in provette EDTA (2-4 ml) per successivi studi sul profilo trascrittomico dell'RNA.

Il sangue venoso verrà raccolto in provette con eparina di litio (6 ml) per i successivi test QuantiFERON TB-Plus (QFT). Inoltre, il sangue verrà raccolto in provette EDTA (per l'analisi degli anticorpi; 4-6 ml).

L'analisi QFT per la categorizzazione dello stato di TBI verrà eseguita entro una settimana dal parto. Il risultato sarà comunicato ai partecipanti alla visita di follow-up di 6 settimane. Al fine di rilevare la tubercolosi subclinica, le donne con trauma cranico verranno indirizzate a una radiografia del torace (indipendentemente dai sintomi) in connessione con questa visita. Verrà inoltre chiesto loro di presentare due campioni di espettorato mattutino per le analisi batteriologiche della tubercolosi come descritto sopra.

Verranno raccolti i risultati dei test di routine ottenuti al momento del ricovero in sala travaglio (HIV, malaria, sifilide, diabete, funzionalità renale, funzionalità epatica, emocromo).

Metodi di laboratorio

Sangue incubato con antigene Mtb:

Il sangue verrà raccolto in provette con eparina di litio e separato in provette QFT per l'incubazione. Dopo l'incubazione, il sangue verrà centrifugato per separare il surnatante dal pellet cellulare. QFT ELISA verrà eseguito secondo le raccomandazioni del produttore. I surnatanti rimanenti verranno conservati in aliquote e i pellet cellulari verranno separati e conservati dopo l'aggiunta dello stabilizzatore di RNA. Il pellet cellulare incubato con Mtb verrà utilizzato per l'analisi sequenziale dell'espressione di RNA da donne selezionate con trauma cranico e malattia tubercolare per analizzare i modelli di attività micobatterica confrontando i modelli nelle donne con infezione da tubercolosi e in quelle con malattia tubercolare (compresi i controlli QFT negativi ). I surnatanti incubati con Mtb verranno analizzati per le citochine legate all'attività della tubercolosi (sulla base dei dati di precedenti studi sulla dinamica immunitaria della tubercolosi durante la gravidanza), utilizzando le piattaforme tecnologiche Luminex.

Sangue non incubato:

Il sangue venoso sarà ottenuto in provette EDTA per l'analisi degli anticorpi specifici per Mtb.

Placenta:

Porzioni di tessuto placentare saranno ottenute da diverse parti di parti macroscopicamente normali della placenta. Verranno ottenute porzioni sia per studi istopatologici (formalina) che per altri studi (per la conservazione in congelatore). Tutte le porzioni saranno etichettate con codici individuali.

Metodi per obiettivi di studio specifici:

1. Confrontare l'istopatologia placentare nelle donne con e senza infezione/malattia tubercolare.

   A questo scopo, sezioni di placenta inclusa in paraffina verranno analizzate per diversi tipi di alterazioni patologiche. Inoltre, la microscopia elettronica sarà condotta da un sottogruppo di partecipanti. Gli esaminatori non saranno in grado di vedere lo stato del TBI e altre caratteristiche dei partecipanti. Verranno valutati i cambiamenti istopatologici. Successivamente, verrà effettuato il confronto per quanto riguarda lo stato del trauma cranico per determinare se il verificarsi di cambiamenti patologici differisce tra queste categorie, con aggiustamento per condizioni concomitanti rilevanti.

2. Confrontare i modelli di espressione dell'RNA nel tessuto placentare in donne con e senza infezione/malattia tubercolare e correlare questi risultati con i modelli associati a disturbi della gravidanza e disfunzione placentare.

   A questo scopo, i modelli di espressione dell'RNA saranno analizzati nel tessuto placentare di donne con e senza infezione/malattia tubercolare, nonché di donne con e senza complicazioni predefinite della gravidanza (pre-eclampsia, restrizione della crescita intrauterina). I partecipanti per questo obiettivo dello studio saranno selezionati dalla coorte totale, in base allo stato di infezione/malattia della tubercolosi. Al fine di evitare effetti dovuti al travaglio, per questa analisi verranno inclusi solo i partecipanti con CS elettivo (placenta non lavorata).

   Il sequenziamento di massa verrà utilizzato per l'analisi della trascrittomica dell'RNA. I modelli dei geni differenzialmente espressi saranno determinati in queste categorie, con analisi bioinformatica su come i geni differenzialmente espressi nelle donne con infezione/malattia tubercolare siano correlati a quelli nelle donne con disturbi della gravidanza (dalla popolazione in studio e dalla letteratura). Questi modelli verranno anche confrontati con gli esiti della gravidanza individuale (esito avverso, deviazioni del peso alla nascita).

3. Analizzare l'espressione proteica nel tessuto placentare nelle donne in gravidanza con e senza trauma cranico e correlare questi modelli con la patologia placentare.

   A questo scopo, i pattern di espressione proteica in porzioni di tessuto placentare non travasato saranno caratterizzati rispetto allo stato di infezione/malattia della tubercolosi. L'analisi verrà effettuata utilizzando la spettrometria di massa. I pattern di espressione proteica rilevati verranno successivamente correlati alla patologia placentare e alle caratteristiche dell'esito della gravidanza.

4. Determinare la presenza di Mtb nel tessuto placentare nelle donne con trauma cranico. A questo scopo, verranno inclusi partecipanti con infezione/malattia tubercolare (insieme a un numero di controlli con risultati QFT negativi). Porzioni di tessuto placentare verranno studiate con metodi per determinare la presenza di Mtb, comprese tecniche di istochimica immunitaria/ibridazione in situ e sonde specifiche per Mtb sviluppate per l'uso in campioni di tessuto paraffinato.

5. Confrontare i fenotipi delle cellule immunitarie nel tessuto placentare in donne in gravidanza con e senza infezione/malattia tubercolare e correlare questi modelli con la patologia placentare.

   A questo scopo, il tessuto placentare incluso in paraffina verrà utilizzato per identificare i fenotipi delle cellule immunitarie nelle donne per quanto riguarda lo stato di trauma cranico. A questo scopo verranno eseguite metodiche immunoistochimiche.

6. Analizzare la secrezione di citochine specifiche per Mtb e i modelli di espressione dell'RNA nel sangue stimolato dall'antigene Mtb nelle donne con infezione/malattia di tubercolosi per delineare gruppi di donne con diversi tipi di attività della tubercolosi durante la gravidanza e per correlare questi modelli con i risultati della placenta.

   A questo scopo, le donne con trauma cranico saranno caratterizzate rispetto ai profili immunitari che riflettono l'attività della tubercolosi. Queste indagini saranno basate su supernatanti e pellet cellulari incubati con Mtb, utilizzando tecniche Luminex per l'analisi delle citochine specifiche di Mtb. I modelli di espressione dell'RNA saranno analizzati utilizzando il sequenziamento di partecipanti selezionati (donne con trauma cranico, donne con malattia tubercolare e donne QFT negative), seguito da qPCR mirato a geni espressi in modo differenziale da un numero maggiore di donne con infezione/malattia tubercolare e donne QFT negative (al fine di identificare le donne con diversi tipi di infezione da tubercolosi, malattia incipiente e subclinica). I risultati della placenta verranno confrontati tra questi gruppi, con aggiustamenti per altri fattori che possono influenzare la funzione e lo sviluppo della placenta.

7. Analizzare gli anticorpi specifici per la tubercolosi nei surnatanti dei linfociti di donne in gravidanza con trauma cranico per caratterizzare l'attività micobatterica e lo stadio della malattia tubercolare. A questo scopo, gli anticorpi specifici per BCG saranno analizzati nei surnatanti di PBMC in coltura di donne con trauma cranico. Le PBMC verranno isolate utilizzando provette di preparazione cellulare, con coltura su terreni adattati. I surnatanti delle colture verranno analizzati per la presenza di anticorpi specifici per BCG e questi modelli verranno confrontati tra i partecipanti per distinguere sottogruppi di donne per quanto riguarda la tubercolosi attiva o incipiente (con confronto dei modelli nelle donne con malattia tubercolare clinica e controlli QFT negativi) .