Влияние туберкулезной инфекции на развитие и функцию плаценты

Фон:

Туберкулез (ТБ) является важной причиной материнской заболеваемости и смертности во всем мире, причем самое большое бремя приходится на страны с низким уровнем дохода. Согласно данным регистровых исследований, проведенных в Европе, беременность связана с увеличением заболеваемости туберкулезом, что позволяет предположить, что беременность может способствовать прогрессированию туберкулезной инфекции (ЧМТ). В когорте беременных женщин, живущих в Адаме, крупном городе Эфиопии, у трети участниц была ЧМТ. Тем не менее, заболеваемость туберкулезом во время беременности и послеродового наблюдения в этой когорте была относительно низкой (8 случаев среди 2000 участниц в течение 4 лет наблюдения). Интересно, что уровни провоспалительных цитокинов, запускаемых Mtb, повышались на более поздних стадиях беременности, что указывает на повышенную бактериальную активность во время беременности у женщин с ЧМТ. Кроме того, маркеры неспецифического системного воспаления у беременных с ЧМТ были выше по сравнению с беременными без ЧМТ. Вполне вероятно, что оба этих явления связаны с индуцированной беременностью иммунной модификацией контроля над туберкулезом.

Последствия этих иммунных изменений во время беременности недостаточно изучены. Помимо повышенного риска прогрессирования заболевания туберкулезом, ЧМТ у беременных женщин может иметь и другие неблагоприятные последствия для здоровья, в частности, в отношении исхода беременности. В недавнем регистровом исследовании женщин, живущих в Швеции и родом из эндемичных по туберкулезу стран, прошедших скрининг на ЧМТ в дородовом уходе, было обнаружено, что ЧМТ связана с несколькими типами неблагоприятных исходов беременности. Это открытие предполагает, что ЧМТ может влиять на развитие и функцию плаценты и, таким образом, способствовать осложнениям беременности. В неблагоприятном воздействии материнской инфекции на исход беременности могут быть задействованы несколько механизмов, включая прямое инфицирование ткани плода и/или плаценты, а также косвенные эффекты, опосредованные системным воспалением, влияющие на развитие и функцию плаценты.

Этот проект представляет собой углубленное исследование связи между ЧМТ, заболеванием туберкулезом и патологией плаценты, основанное на группе женщин, родивших в государственных больницах Эфиопии. Общая цель - изучить патологию плаценты и маркеры плацентарной дисфункции у женщин с туберкулезной инфекцией и туберкулезом, их корреляцию с иммунными реакциями Mtb и маркерами микобактериальной активности, а также с характеристиками нарушений беременности.

Описание проекта Участники будут набраны и помещены в родильные отделения двух государственных специализированных больниц в Аддис-Абебе, Эфиопия. Процедуры исследования будут выполнять медсестры-исследователи и исследовательский персонал, а также обученный штатный персонал в соответствующих исследовательских центрах. Учебные процедуры в основном будут проводиться в дневное время в будние дни.

Данные исследования будут получены как до, так и после родов. Информация от участников исследования будет собираться с использованием электронных структурированных вопросников, включая вопросы о социально-демографическом состоянии, медицинском и акушерском анамнезе (текущая и предыдущая беременность), а также других переменных, рекомендованных базой данных Global Pregnancy Collaboration COLLECT. Будут зарегистрированы подробные данные о физическом состоянии матери и ребенка (вес, рост, окружность середины плеча, оценка по шкале Апгар), а также подробности родов. Данные исследования будут вводиться и загружаться с помощью планшетов, подключенных к серверу REDCAP. Образцы крови для исследовательских целей будут получены в родильном отделении перед родами. Перед выпиской из больницы с женщинами снова свяжутся сотрудники исследования для получения дополнительной информации об исследовании. В это время участники также получат запланированную дату последующего шестинедельного визита, а также контактные данные исследовательской группы.

Женщинам с симптомами или признаками, указывающими на заболевание туберкулезом, будет предложено сдать два утренних образца мокроты для бактериологического исследования на туберкулез. Другие исследования будут проводиться у женщин с подозрением на внелегочный туберкулез (в зависимости от типа проявления; например, тонкоигольная аспирация при периферической лимфаденопатии).

Обо всей плаценте позаботятся в течение 30 минут после родов сотрудники исследования патологии. Во-первых, плацента будет охарактеризована физически и макроскопически в соответствии с протоколом исследования, основанным на рекомендациях Амстердамской группы плацентарного семинара. Затем плаценту хранят в формалине, а затем отдельные ее части заливают в парафин для гистопатологических исследований. Кроме того (у женщин с неродившейся беременностью, родивших в центре исследования TASH), будут получены части ткани плаценты для анализа экспрессии РНК и белка, а также для электронной микроскопии. Эти порции будут заморожены на сухом льду с последующим переносом в -80°С. Непосредственно после родов пуповинную кровь будут собирать в пробирки с ЭДТА (2-4 мл) для последующих исследований транскриптомного профиля РНК.

Венозная кровь будет собрана в пробирки с литий-гепарином (6 мл) для последующего тестирования QuantiFERON TB-Plus (QFT). Кроме того, кровь будет собрана в пробирки с ЭДТА (для анализа на антитела; 4-6 мл).

Анализ QFT для категоризации статуса ЧМТ будет выполнен в течение одной недели после родов. Результат будет сообщен участникам во время последующего визита через 6 недель. Для выявления субклинической формы туберкулеза женщины с ЧМТ будут направлены на рентгенографию грудной клетки (независимо от симптомов) в связи с этим визитом. Их также попросят сдать два утренних образца мокроты для бактериологического анализа на туберкулез, как описано выше.

Будут собраны результаты рутинных тестов, полученных при поступлении в родильное отделение (ВИЧ, малярия, сифилис, диабет, функция почек, функция печени, анализ крови).

Лабораторные методы

Кровь, инкубированная с антигеном Mtb:

Кровь будет собрана в пробирки с литий-гепарином и разделена на пробирки QFT для инкубации. После инкубации кровь центрифугируют для отделения супернатанта от клеточного осадка. QFT ELISA будет проводиться в соответствии с рекомендациями производителя. Оставшиеся супернатанты будут храниться в аликвотах, а осадки клеток будут отделяться и храниться после добавления РНК-стабилизатора. Осадок клеток, инкубированный с Mtb, будет использоваться для последовательного анализа экспрессии РНК у выбранных женщин с ЧМТ и туберкулезом для анализа моделей микобактериальной активности путем сравнения закономерностей у женщин с туберкулезной инфекцией и у женщин с туберкулезом (включая QFT-отрицательные контрольные образцы). ). Супернатанты, инкубированные с Mtb, будут проанализированы на наличие цитокинов, связанных с активностью туберкулеза (на основе данных предыдущих исследований динамики иммунитета к туберкулезу во время беременности) с использованием технологических платформ Luminex.

Неинкубированная кровь:

Венозную кровь будут брать в пробирки с ЭДТА для анализа Mtb-специфичных антител.

Плацента:

Части ткани плаценты будут получены из разных частей макроскопически нормальных частей плаценты. Порции будут получать как для гистопатологических (формалин), так и для других исследований (для хранения в морозильной камере). Все части будут маркированы индивидуальными кодами.

Методы для конкретных целей исследования:

1. Сравнить гистопатологию плаценты у женщин с туберкулезной инфекцией/заболеванием и без нее.

   С этой целью срезы залитой в парафин плаценты будут проанализированы на предмет различных типов патологических изменений. Кроме того, электронная микроскопия будет проводиться у части участников. Эксперты не будут знать о статусе ЧМТ и других характеристиках участников. Гистопатологические изменения будут оценены. Впоследствии будет проведено сравнение статуса ЧМТ, чтобы определить, различается ли возникновение патологических изменений между этими категориями, с поправкой на соответствующие сопутствующие состояния.

2. Сравнить закономерности экспрессии РНК в ткани плаценты у женщин с туберкулезной инфекцией/заболеванием и без нее и сопоставить эти результаты с закономерностями, связанными с нарушениями беременности и плацентарной дисфункцией.

   С этой целью будут проанализированы закономерности экспрессии РНК в ткани плаценты женщин с туберкулезной инфекцией/заболеванием и без нее, а также женщин с заранее определенными осложнениями беременности и без них (преэклампсия, задержка внутриутробного развития). Участники данного исследования будут выбраны из общей когорты на основе статуса инфекции/заболевания туберкулезом. Чтобы избежать последствий родов, в этот анализ будут включены только участники с плановым КС (неродившаяся плацента).

   Массовое секвенирование будет использоваться для анализа транскриптомики РНК. В этих категориях будут определены закономерности дифференциально экспрессируемых генов с помощью биоинформационного анализа того, как дифференциально экспрессируемые гены у женщин с туберкулезной инфекцией/заболеванием коррелируют с таковыми у женщин с нарушениями беременности (из исследуемой популяции и из литературы). Эти закономерности также будут сравниваться с индивидуальными исходами беременности (неблагоприятный исход, отклонения веса при рождении).

3. Проанализировать экспрессию белка в ткани плаценты у беременных с ЧМТ и без нее и соотнести эти закономерности с патологией плаценты.

   С этой целью паттерны экспрессии белка в частях неопробованной ткани плаценты будут охарактеризованы с учетом статуса туберкулезной инфекции/заболевания. Анализ будет проводиться с помощью масс-спектрометрии. Обнаруженные закономерности экспрессии белка впоследствии будут коррелировать с патологией плаценты и характеристиками исхода беременности.

4. Определить наличие Mtb в плацентарной ткани у женщин с ЧМТ. С этой целью будут включены участники с инфекцией/заболеванием туберкулезом (наряду с рядом контрольных групп с отрицательными результатами QFT). Части плацентарной ткани будут исследованы с использованием методов определения присутствия Mtb, включая методы иммунной гистохимии/гибридизации in-situ и специфичные для Mtb зонды, которые были разработаны для использования в парафинированных образцах тканей.

5. Сравнить фенотипы иммунных клеток в плацентарной ткани у беременных женщин с туберкулезной инфекцией/заболеванием и без нее и сопоставить эти закономерности с патологией плаценты.

   С этой целью ткань плаценты, залитая парафином, будет использоваться для идентификации фенотипов иммунных клеток у женщин в зависимости от статуса ЧМТ. Для этой цели будут использованы методы иммуногистохимии.

6. Проанализировать закономерности секреции Mtb-специфических цитокинов и экспрессии РНК в крови, стимулированной антигеном Mtb, у женщин с туберкулезной инфекцией/заболеванием, чтобы выделить группы женщин с различными типами активности туберкулеза во время беременности и сопоставить эти закономерности с данными плаценты.

   С этой целью женщин с ЧМТ будут характеризовать с точки зрения иммунного профиля, отражающего активность туберкулеза. Эти исследования будут основаны на инкубированных Mtb супернатантах и ​​клеточных осадках с использованием методов Luminex для анализа Mtb-специфичных цитокинов. Паттерны экспрессии РНК будут проанализированы с использованием секвенирования у выбранных участников (женщин с ЧМТ, женщин с туберкулезом и женщин с отрицательным QFT), после чего будет проведена кПЦР, нацеленная на дифференциально экспрессируемые гены от большего числа женщин с инфекцией/заболеванием туберкулезом и женщин с отрицательным QFT. (с целью выявления женщин с различными формами туберкулезной инфекции, начальной и субклинической формой заболевания). Результаты плаценты будут сравниваться между этими группами с поправкой на другие факторы, которые могут повлиять на функцию и развитие плаценты.

7. Анализ туберкулез-специфических антител в супернатантах лимфоцитов беременных женщин с ЧМТ для характеристики микобактериальной активности и стадии заболевания туберкулезом. С этой целью БЦЖ-специфические антитела будут анализироваться в супернатантах культивированных РВМС женщин с ЧМТ. РВМС будут выделены с использованием пробирок для подготовки клеток с культурой на адаптированной среде. Супернатанты культур будут проанализированы на наличие БЦЖ-специфических антител, и эти закономерности будут сравниваться между участниками, чтобы различить подгруппы женщин в отношении активного или начинающегося туберкулеза (со сравнением закономерностей у женщин с клиническим заболеванием туберкулезом и QFT-отрицательным контролем). .