Auswirkungen einer Tuberkulose-Infektion auf Entwicklung und Funktion der Plazenta

Hintergrund:

Tuberkulose (TB) ist weltweit eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität bei Müttern, wobei die Belastung in Ländern mit niedrigem Einkommen am höchsten ist. In Registerstudien aus Europa wurde eine Schwangerschaft mit einer erhöhten Inzidenz von Tuberkuloseerkrankungen in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass eine Schwangerschaft das Fortschreiten einer Tuberkuloseinfektion (TBI) fördern kann. In einer Kohorte schwangerer Frauen, die in Adama, einer großen äthiopischen Stadt, lebten, hatte ein Drittel der Teilnehmer ein Schädel-Hirn-Trauma. Dennoch war die Inzidenz von TB-Erkrankungen während der Schwangerschaft und der Nachbeobachtung nach der Geburt in dieser Kohorte relativ gering (8 Fälle unter 2000 Teilnehmern während der Nachbeobachtungszeit von 4 Jahren). Interessanterweise waren die Spiegel der durch Mtb ausgelösten proinflammatorischen Zytokine in späteren Stadien der Schwangerschaft erhöht, was auf eine erhöhte bakterielle Aktivität während der Schwangerschaft bei Frauen mit Schädel-Hirn-Trauma hindeutet. Darüber hinaus waren unspezifische systemische Entzündungsmarker bei schwangeren Frauen mit TBI höher als bei schwangeren Frauen ohne TBI. Es ist wahrscheinlich, dass beide Phänomene auf eine schwangerschaftsbedingte Immunveränderung der Tuberkulosekontrolle zurückzuführen sind.

Die Folgen dieser Immunveränderungen in der Schwangerschaft wurden nicht umfassend untersucht. Abgesehen von einem erhöhten Risiko für das Fortschreiten einer Tuberkuloseerkrankung ist es möglich, dass TBI bei schwangeren Frauen weitere negative Auswirkungen auf die Gesundheit haben könnte, insbesondere im Hinblick auf den Schwangerschaftsausgang. In einer kürzlich durchgeführten Registerstudie mit in Schweden lebenden Frauen aus Ländern mit Tuberkuloseendemie, die in der Schwangerschaftsvorsorge auf TBI untersucht wurden, wurde festgestellt, dass TBI mit mehreren Arten von ungünstigen Schwangerschaftsausgängen verbunden ist. Dieser Befund legt nahe, dass TBI die Entwicklung und Funktion der Plazenta beeinträchtigen und somit zu Schwangerschaftskomplikationen beitragen könnte. An den nachteiligen Auswirkungen einer mütterlichen Infektion auf den Schwangerschaftsausgang können mehrere Mechanismen beteiligt sein, darunter eine direkte Infektion des fetalen und/oder plazentaren Gewebes sowie indirekte, durch systemische Entzündungen vermittelte Auswirkungen mit Auswirkungen auf die Entwicklung und Funktion der Plazenta.

Bei diesem Projekt handelt es sich um eine eingehende Studie über die Zusammenhänge zwischen Schädel-Hirn-Trauma und Tuberkulose-Erkrankung und Plazenta-Pathologie, basierend auf einer Kohorte von Frauen mit Entbindungen in öffentlichen Krankenhäusern Äthiopiens. Das übergeordnete Ziel besteht darin, die Pathologie der Plazenta und Marker für eine Plazentadysfunktion bei Frauen mit Tuberkulose-Infektion und Tuberkulose-Erkrankung zu untersuchen, mit Korrelation zu Mtb-Immunantworten und Markern für mykobakterielle Aktivität und zu Merkmalen von Schwangerschaftsstörungen.

Projektbeschreibung: Die Teilnehmer werden rekrutiert und auf Arbeitsstationen in zwei öffentlichen Überweisungskrankenhäusern in Addis Abeba, Äthiopien, eingeschrieben. Die Studienabläufe werden von Forschungskrankenschwestern und Forschungspersonal sowie von geschultem Stammpersonal an den jeweiligen Studienstandorten durchgeführt. Studienabläufe werden hauptsächlich tagsüber an Wochentagen durchgeführt.

Studiendaten werden sowohl vor als auch nach der Lieferung erhoben. Informationen von Studienteilnehmern werden mithilfe elektronisch strukturierter Fragebögen gesammelt, einschließlich Fragen zum soziodemografischen Zustand, zur medizinischen und geburtshilflichen Vorgeschichte (aktuelle und frühere Schwangerschaften) sowie zu anderen von der Global Pregnancy Collaboration COLLECT-Datenbank empfohlenen Variablen. Detaillierte Daten zum körperlichen Zustand von Mutter und Kind (Gewicht, Größe, mittlerer Oberarmumfang, Apgar-Score) sowie Einzelheiten zur Entbindung werden registriert. Studiendaten werden über Tablets eingegeben und hochgeladen, die mit einem REDCAP-Server verbunden sind. Vor der Entbindung werden auf der Entbindungsstation Blutproben zu Forschungszwecken entnommen. Vor der Entlassung aus dem Krankenhaus werden die Frauen erneut vom Studienpersonal kontaktiert, um weitere Informationen zur Studie zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt erhalten die Teilnehmer auch einen geplanten Termin für den 6-wöchigen Nachuntersuchungsbesuch sowie Kontaktdaten des Studienteams.

Frauen mit Symptomen oder Anzeichen, die auf eine Tuberkuloseerkrankung hinweisen, werden gebeten, morgens zwei Sputumproben für bakteriologische Tuberkuloseuntersuchungen einzusenden. Bei Frauen mit Verdacht auf extrapulmonale Tuberkulose werden weitere Untersuchungen durchgeführt (abhängig von der Art der Präsentation; zum Beispiel Feinnadelpunktion bei peripherer Lymphadenopathie).

Die gesamte Plazenta wird innerhalb von 30 Minuten nach der Entbindung vom Personal der Studienpathologie behandelt. Zunächst wird die Plazenta anhand eines Studienprotokolls, das auf den Empfehlungen der Amsterdam Placental Workshop Group basiert, physisch und makroskopisch charakterisiert. Anschließend wird die Plazenta in Formalin gelagert und später ausgewählte Teile für histopathologische Untersuchungen in Paraffin eingebettet. Darüber hinaus werden (von Frauen mit unvermittelter Schwangerschaft, die am TASH-Studienstandort entbinden) Teile des Plazentagewebes für RNA- und Proteinexpressionsanalysen sowie für die Elektronenmikroskopie entnommen. Diese Portionen werden auf Trockeneis eingefroren und anschließend auf -80 °C überführt. Direkt nach der Entbindung wird Nabelschnurblut in EDTA-Röhrchen (2–4 ml) für nachfolgende Studien zum transkriptomischen RNA-Profil gesammelt.

Für den anschließenden QuantiFERON TB-Plus (QFT)-Test wird venöses Blut in Lithium-Heparin-Röhrchen (6 ml) gesammelt. Zusätzlich wird Blut in EDTA-Röhrchen (für Antikörperanalysen; 4-6 ml) gesammelt.

Die QFT-Analyse zur Kategorisierung des TBI-Status wird innerhalb einer Woche nach der Entbindung durchgeführt. Das Ergebnis wird den Teilnehmern beim Nachuntersuchungsbesuch nach 6 Wochen mitgeteilt. Um eine subklinische Tuberkulose zu erkennen, werden Frauen mit Schädel-Hirn-Trauma im Zusammenhang mit diesem Besuch zu einer Röntgenaufnahme des Brustkorbs (unabhängig von den Symptomen) überwiesen. Sie werden außerdem gebeten, zwei morgendliche Sputumproben für bakteriologische TB-Analysen einzusenden, wie oben beschrieben.

Ergebnisse von Routinetests, die bei der Aufnahme in die Wehenstation durchgeführt wurden, werden gesammelt (HIV, Malaria, Syphilis, Diabetes, Nierenfunktion, Leberfunktion, Blutbild).

Labormethoden

Mit Mtb-Antigen inkubiertes Blut:

Das Blut wird in Lithium-Heparin-Röhrchen gesammelt und zur Inkubation in QFT-Röhrchen aufgeteilt. Nach der Inkubation wird das Blut zentrifugiert, um den Überstand vom Zellpellet zu trennen. Der QFT-ELISA wird gemäß der Empfehlung des Herstellers durchgeführt. Die verbleibenden Überstände werden in Aliquots gelagert und die Zellpellets werden nach Zugabe von RNA-Stabilisator abgetrennt und gelagert. Das mit Mtb inkubierte Zellpellet wird für die sequenzbasierte Analyse der RNA-Expression ausgewählter Frauen mit TBI und Tuberkulose-Erkrankung verwendet, um mykobakterielle Aktivitätsmuster durch Vergleich der Muster bei Frauen mit Tuberkulose-Infektion und Frauen mit Tuberkulose-Erkrankung (einschließlich QFT-negativer Kontrollen) zu analysieren ). Mit Mtb inkubierte Überstände werden mithilfe von Luminex-Technologieplattformen auf Zytokine analysiert, die mit der TB-Aktivität in Zusammenhang stehen (basierend auf Daten aus früheren Studien zur TB-Immundynamik während der Schwangerschaft).

Nicht inkubiertes Blut:

Zur Analyse von Mtb-spezifischen Antikörpern wird venöses Blut in EDTA-Röhrchen entnommen.

Plazenta:

Teile des Plazentagewebes werden aus verschiedenen Teilen makroskopisch normaler Teile der Plazenta gewonnen. Es werden Portionen sowohl für histopathologische (Formalin) als auch für andere Untersuchungen (zur Lagerung im Gefrierschrank) entnommen. Alle Portionen werden mit individuellen Codes gekennzeichnet.

Methoden für spezifische Studienziele:

1. Vergleich der Plazenta-Histopathologie bei Frauen mit und ohne Tuberkulose-Infektion/-Erkrankung.

   Zu diesem Zweck werden Abschnitte der in Paraffin eingebetteten Plazenta auf verschiedene Arten pathologischer Veränderungen untersucht. Darüber hinaus wird bei einer Untergruppe der Teilnehmer eine Elektronenmikroskopie durchgeführt. Den Prüfern wird der TBI-Status und andere Merkmale der Teilnehmer nicht bekannt sein. Die histopathologischen Veränderungen werden bewertet. Anschließend wird ein Vergleich hinsichtlich des TBI-Status durchgeführt, um festzustellen, ob sich das Auftreten pathologischer Veränderungen zwischen diesen Kategorien unterscheidet, unter Berücksichtigung relevanter Begleiterkrankungen.

2. Vergleich der RNA-Expressionsmuster im Plazentagewebe bei Frauen mit und ohne TB-Infektion/-Erkrankung und Korrelation dieser Ergebnisse mit Mustern im Zusammenhang mit Schwangerschaftsstörungen und Plazentadysfunktion.

   Zu diesem Zweck werden RNA-Expressionsmuster im Plazentagewebe von Frauen mit und ohne Tuberkulose-Infektion/-Erkrankung sowie von Frauen mit und ohne vordefinierte Schwangerschaftskomplikationen (Präeklampsie, intrauterine Wachstumsbeschränkung) analysiert. Teilnehmer für dieses Studienziel werden aus der Gesamtkohorte basierend auf dem Tuberkulose-Infektions-/Krankheitsstatus ausgewählt. Um Auswirkungen durch Wehen zu vermeiden, werden nur Teilnehmer mit elektivem CS in diese Analyse einbezogen (Plazenta ohne Wehen).

   Die Massensequenzierung wird zur Analyse der RNA-Transkriptomik verwendet. In diesen Kategorien werden Muster unterschiedlich exprimierter Gene bestimmt, wobei bioinformatisch analysiert wird, wie unterschiedlich exprimierte Gene von Frauen mit Tuberkulose-Infektion/-Erkrankung mit denen von Frauen mit Schwangerschaftsstörungen korrelieren (aus der Studienpopulation und aus der Literatur). Diese Muster werden auch mit den individuellen Schwangerschaftsergebnissen (unerwünschter Ausgang, Abweichungen vom Geburtsgewicht) verglichen.

3. Analyse der Proteinexpression im Plazentagewebe bei schwangeren Frauen mit und ohne Schädel-Hirn-Trauma und Korrelation dieser Muster mit der Pathologie der Plazenta.

   Zu diesem Zweck werden Proteinexpressionsmuster in Teilen von unbelastetem Plazentagewebe im Hinblick auf den Tuberkulose-Infektions-/Krankheitsstatus charakterisiert. Die Analyse erfolgt mittels Massenspektrometrie. Die gefundenen Proteinexpressionsmuster werden anschließend mit der Pathologie der Plazenta und den Merkmalen des Schwangerschaftsausgangs korreliert.

4. Bestimmung des Vorhandenseins von Mtb im Plazentagewebe bei Frauen mit SHT. Zu diesem Zweck werden Teilnehmer mit einer TB-Infektion/-Erkrankung einbezogen (zusammen mit einer Reihe von Kontrollpersonen mit negativen QFT-Ergebnissen). Teile des Plazentagewebes werden mit Methoden zur Bestimmung des Vorhandenseins von Mtb untersucht, einschließlich Immunhistochemie/In-situ-Hybridisierungstechniken und Mtb-spezifischen Sonden, die für den Einsatz in paraffinisierten Gewebeproben entwickelt wurden.

5. Vergleich der Phänotypen von Immunzellen im Plazentagewebe bei schwangeren Frauen mit und ohne Tuberkulose-Infektion/-Erkrankung und Korrelation dieser Muster mit der Pathologie der Plazenta.

   Zu diesem Zweck wird in Paraffin eingebettetes Plazentagewebe verwendet, um Immunzellphänotypen bei Frauen im Hinblick auf den TBI-Status zu identifizieren. Zu diesem Zweck werden immunhistochemische Methoden durchgeführt.

6. Analyse der Mtb-spezifischen Zytokin-Sekretion und RNA-Expressionsmuster in Mtb-Antigen-stimuliertem Blut bei Frauen mit Tuberkulose-Infektion/-Erkrankung, um Gruppen von Frauen mit unterschiedlichen Arten von Tuberkulose-Aktivität während der Schwangerschaft abzugrenzen und diese Muster mit Plazentabefunden zu korrelieren.

   Zu diesem Zweck werden Frauen mit TBI hinsichtlich ihrer Immunprofile charakterisiert, die die TB-Aktivität widerspiegeln. Diese Untersuchungen werden auf mit Mtb inkubierten Überständen und Zellpellets basieren und Luminex-Techniken zur Analyse von Mtb-spezifischen Zytokinen verwenden. RNA-Expressionsmuster werden mithilfe der Sequenzierung ausgewählter Teilnehmer (Frauen mit Schädel-Hirn-Trauma, Frauen mit Tuberkulose-Erkrankung und QFT-negative Frauen) analysiert, gefolgt von einer qPCR, die auf differenziell exprimierte Gene einer größeren Anzahl von Frauen mit Tuberkulose-Infektion/-Erkrankung und QFT-negativen Frauen abzielt (um Frauen mit verschiedenen Arten von Tuberkuloseinfektionen, beginnender und subklinischer Erkrankung zu identifizieren). Die Plazentabefunde werden zwischen diesen Gruppen verglichen, wobei andere Faktoren berücksichtigt werden, die die Funktion und Entwicklung der Plazenta beeinflussen können.

7. Analyse von TB-spezifischen Antikörpern in Lymphozytenüberständen bei schwangeren Frauen mit TBI zur Charakterisierung der mykobakteriellen Aktivität und des Stadiums der TB-Erkrankung. Zu diesem Zweck werden BCG-spezifische Antikörper in Überständen von kultivierten PBMCs von Frauen mit TBI analysiert. PBMCs werden mithilfe von Zellvorbereitungsröhrchen isoliert und auf angepassten Medien kultiviert. Kulturüberstände werden auf das Vorhandensein von BCG-spezifischen Antikörpern analysiert und diese Muster werden zwischen den Teilnehmern verglichen, um Untergruppen von Frauen im Hinblick auf aktive oder beginnende Tuberkulose zu unterscheiden (mit Vergleich der Muster bei Frauen mit klinischer Tuberkulose-Erkrankung und QFT-negativen Kontrollen). .