Wpływ zakażenia gruźlicą na rozwój i funkcję łożyska

Tło:

Gruźlica (TB) jest ważną przyczyną zachorowalności i umieralności matek na całym świecie, a największe obciążenie występuje w krajach o niskich dochodach. W badaniach rejestrowych przeprowadzonych w Europie powiązano ciążę ze zwiększoną częstością występowania gruźlicy, co sugeruje, że ciąża może sprzyjać postępowi zakażenia gruźlicą (TBI). W kohorcie kobiet w ciąży mieszkających w Adamie, głównym mieście Etiopii, jedna trzecia uczestniczek cierpiała na TBI. Jednak częstość występowania gruźlicy w czasie ciąży i obserwacji poporodowej w tej kohorcie była stosunkowo niska (8 przypadków na 2000 uczestniczek w ciągu 4 lat obserwacji). Co ciekawe, poziom cytokin prozapalnych wyzwalanych przez Mtb był podwyższony w późniejszych stadiach ciąży, co sugeruje zwiększoną aktywność bakterii podczas ciąży u kobiet z TBI. Ponadto niespecyficzne markery ogólnoustrojowego zapalenia u kobiet w ciąży z TBI były wyższe w porównaniu z kobietami w ciąży bez TBI. Jest prawdopodobne, że oba te zjawiska wynikają z wywołanych ciążą modyfikacji immunologicznych kontroli gruźlicy.

Konsekwencje tych zmian immunologicznych w czasie ciąży nie zostały szczegółowo zbadane. Oprócz zwiększonego ryzyka progresji do gruźlicy, możliwe jest, że TBI u kobiet w ciąży może mieć inne niekorzystne skutki zdrowotne, w szczególności w odniesieniu do przebiegu ciąży. W niedawnym badaniu opartym na rejestrach, w którym uczestniczyły kobiety mieszkające w Szwecji pochodzące z krajów endemicznych gruźlicy, poddane badaniom przesiewowym w kierunku TBI w opiece przedporodowej, stwierdzono, że TBI wiąże się z kilkoma rodzajami niekorzystnych wyników ciąży. Odkrycie to sugeruje, że TBI może wpływać na rozwój i funkcję łożyska, a tym samym może przyczyniać się do powikłań ciąży. W niepożądanym wpływie zakażenia matki na przebieg ciąży może brać udział kilka mechanizmów, w tym bezpośrednie zakażenie tkanki płodu i/lub łożyska, a także skutki pośrednie, w których pośredniczy ogólnoustrojowy stan zapalny, wpływający na rozwój i funkcję łożyska.

Projekt ten stanowi dogłębne badanie dotyczące powiązań między TBI i gruźlicą a patologią łożyska, przeprowadzone na kohorcie kobiet, które rodziły w etiopskich szpitalach publicznych. Ogólnym celem jest zbadanie patologii łożyska i markerów dysfunkcji łożyska u kobiet z zakażeniem gruźlicą i chorobą gruźliczą, w powiązaniu z odpowiedzią immunologiczną Mtb i markerami aktywności prątków oraz charakterystyką zaburzeń ciąży.

Opis projektu Uczestnicy zostaną rekrutowani i zapisani na oddziały porodowe w dwóch publicznych szpitalach referencyjnych w Addis Abebie w Etiopii. Procedury badawcze będą przeprowadzane przez pielęgniarki badawcze i personel badawczy, a także przez przeszkolony stały personel w odpowiednich ośrodkach badawczych. Procedury badawcze będą prowadzone głównie w ciągu dnia w dni powszednie.

Dane z badania zostaną uzyskane przed porodem i po porodzie. Informacje od uczestniczek badania będą zbierane za pomocą elektronicznych kwestionariuszy, które będą zawierać pytania dotyczące stanu społeczno-demograficznego, historii medycznej i położniczej (ciąże obecne i poprzednie), a także innych zmiennych rekomendowanych przez bazę danych Global Pregnancy Collaboration COLLECT. Zostaną zarejestrowane szczegółowe dane dotyczące stanu fizycznego matki i dziecka (waga, wzrost, obwód połowy ramienia, ocena w skali Apgar), a także szczegóły porodu. Dane z badania zostaną wprowadzone i przesłane za pomocą tabletów podłączonych do serwera REDCAP. Próbki krwi do celów badawczych będą pobierane na oddziale porodowym przed porodem. Przed wypisem ze szpitala personel badawczy ponownie skontaktuje się z kobietami w celu uzyskania dalszych informacji na temat badania. W tym czasie uczestnicy otrzymają również planowany termin 6-tygodniowej wizyty kontrolnej, a także dane kontaktowe zespołu badawczego.

Kobiety z objawami sugerującymi gruźlicę zostaną poproszone o dostarczenie dwóch porannych próbek plwociny do badań bakteriologicznych na gruźlicę. U kobiet z podejrzeniem gruźlicy pozapłucnej zostaną przeprowadzone inne badania (w zależności od rodzaju obrazu; na przykład aspiracja cienkoigłowa w przypadku obwodowej limfadenopatii).

Całe łożysko zostanie zbadane w ciągu 30 minut po porodzie przez personel patologii badawczej. Najpierw łożysko zostanie scharakteryzowane fizycznie i makroskopowo zgodnie z protokołem badania opartym na zaleceniach Amsterdamskiej Grupy Warsztatów Łożyskowych. Łożysko będzie następnie przechowywane w formalinie, a wybrane części zatapiane są w parafinie do badań histopatologicznych. Dodatkowo (od kobiet w ciąży nierodziącej, które rodziły w ośrodku TASH) zostaną pobrane fragmenty tkanki łożyska do analizy ekspresji RNA i białek, a także do mikroskopii elektronowej. Porcje te zostaną zamrożone w suchym lodzie, a następnie przeniesione do temperatury -80°C. Bezpośrednio po porodzie krew pępowinowa zostanie pobrana do probówek EDTA (2-4 ml) do dalszych badań profilu transkryptomicznego RNA.

Krew żylna będzie pobierana do probówek z heparyną litową (6 ml) do późniejszego badania QuantiFERON TB-Plus (QFT). Dodatkowo pobierana będzie krew do probówek z EDTA (do analizy przeciwciał; 4-6 ml).

Analiza QFT w celu kategoryzacji statusu TBI zostanie przeprowadzona w ciągu tygodnia po porodzie. Wynik zostanie przekazany uczestnikom podczas 6-tygodniowej wizyty kontrolnej. W celu wykrycia subklinicznej postaci gruźlicy kobiety z TBI zostaną w związku z tą wizytą skierowane na prześwietlenie klatki piersiowej (niezależnie od objawów). Zostaną także poproszeni o przedstawienie dwóch porannych próbek plwociny do badań bakteriologicznych na gruźlicę, jak opisano powyżej.

Zbierane będą wyniki rutynowych badań uzyskanych przy przyjęciu na oddział porodowy (HIV, malaria, kiła, cukrzyca, czynność nerek, czynność wątroby, morfologia krwi).

Metody laboratoryjne

Krew inkubowana z antygenem Mtb:

Krew zostanie pobrana do probówek z heparyną litową i rozdzielona do probówek QFT w celu inkubacji. Po inkubacji krew zostanie odwirowana w celu oddzielenia supernatantu od osadu komórkowego. Test QFT ELISA zostanie wykonany zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostałe supernatanty będą przechowywane w porcjach, a osady komórkowe zostaną oddzielone i przechowywane po dodaniu stabilizatora RNA. Osad komórek inkubowanych z Mtb zostanie wykorzystany do opartej na sekwencji analizy ekspresji RNA od wybranych kobiet chorych na TBI i gruźlicę w celu analizy wzorców aktywności prątków poprzez porównanie wzorców u kobiet zakażonych gruźlicą i kobiet chorych na gruźlicę (w tym kontrole QFT-ujemne) ). Supernatanty inkubowane w Mtb zostaną przeanalizowane pod kątem cytokin związanych z aktywnością gruźlicy (na podstawie danych z poprzednich badań dotyczących dynamiki odporności na gruźlicę podczas ciąży), przy użyciu platform technologicznych Luminex.

Niewykubowana krew:

Krew żylna zostanie pobrana w probówkach z EDTA w celu analizy przeciwciał swoistych dla Mtb.

Łożysko:

Fragmenty tkanki łożyska zostaną pobrane z różnych części makroskopowo prawidłowych części łożyska. Porcje będą pobierane zarówno do badań histopatologicznych (formalina), jak i innych (do przechowywania w zamrażarce). Wszystkie porcje będą oznaczone indywidualnymi kodami.

Metody dla konkretnych celów badawczych:

1. Porównanie histopatologii łożyska u kobiet z infekcją/chorobą gruźliczą i bez niej.

   W tym celu skrawki łożyska zatopionego w parafinie zostaną poddane analizie pod kątem różnych typów zmian patologicznych. Ponadto u podzbioru uczestników zostanie przeprowadzona mikroskopia elektronowa. Egzaminatorzy będą nieświadomi statusu TBI i innych cech uczestników. Zmiany histopatologiczne zostaną ocenione. Następnie dokonane zostanie porównanie pod względem statusu TBI w celu ustalenia, czy występowanie zmian patologicznych różni się pomiędzy tymi kategoriami, z uwzględnieniem odpowiednich schorzeń współistniejących.

2. Porównanie wzorców ekspresji RNA w tkance łożyska u kobiet z infekcją/chorobą gruźliczą i bez niej oraz korelacja tych wyników z wzorcami związanymi z zaburzeniami ciąży i dysfunkcją łożyska.

   W tym celu zostaną przeanalizowane wzorce ekspresji RNA w tkance łożyska od kobiet z infekcją/chorobą gruźlicą lub bez, a także od kobiet z określonymi powikłaniami ciąży lub bez nich (stan przedrzucawkowy, ograniczenie wzrostu wewnątrzmacicznego). Uczestnicy tego celu badania zostaną wybrani z całej kohorty na podstawie stanu zakażenia/stanu choroby gruźlicy. Aby uniknąć skutków porodu, do tej analizy zostaną włączone wyłącznie uczestniczki z planowym CS (nieporodowe łożysko).

   Do analizy transkryptomiki RNA zostanie wykorzystane sekwencjonowanie masowe. W tych kategoriach zostaną określone wzorce genów o różnej ekspresji, na podstawie analizy bioinformatycznej sprawdzającej, jak geny o różnej ekspresji od kobiet chorych na gruźlicę korelują z genami kobiet z zaburzeniami ciąży (z badanej populacji i z literatury). Wzorce te zostaną również porównane z indywidualnymi wynikami ciąży (niekorzystny wynik, odchylenia od masy urodzeniowej).

3. Analiza ekspresji białek w tkance łożyska u kobiet w ciąży z TBI i bez TBI oraz korelacja tych wzorców z patologią łożyska.

   W tym celu scharakteryzowane zostaną wzorce ekspresji białka w częściach nieobrobionej tkanki łożyska pod kątem zakażenia/statusu choroby gruźlicy. Analiza zostanie przeprowadzona za pomocą spektrometrii mas. Odkryte wzorce ekspresji białek zostaną następnie skorelowane z patologią łożyska i charakterystyką przebiegu ciąży.

4. Określenie obecności Mtb w tkance łożyska u kobiet z TBI. W tym celu uwzględnieni zostaną uczestnicy z zakażeniem/chorobą gruźlicą (wraz z pewną liczbą osób kontrolnych z ujemnymi wynikami QFT). Fragmenty tkanki łożyska zostaną zbadane metodami określania obecności Mtb, w tym histochemią immunologiczną/technikami hybrydyzacji in situ oraz sondami specyficznymi dla Mtb, które zostały opracowane do stosowania w próbkach tkanek parafinowanych.

5. Porównanie fenotypów komórek odpornościowych w tkance łożyska u kobiet w ciąży z infekcją/chorobą gruźlicą i bez niej oraz korelacja tych wzorców z patologią łożyska.

   W tym celu tkanka łożyska zatopiona w parafinie zostanie wykorzystana do identyfikacji fenotypów komórek odpornościowych u kobiet pod kątem statusu TBI. W tym celu zostaną wykorzystane metody immunohistochemiczne.

6. Analiza wzorców wydzielania cytokin specyficznych dla Mtb i ekspresji RNA we krwi stymulowanej antygenem Mtb u kobiet z infekcją/chorobą gruźlicy w celu wyznaczenia grup kobiet z różnymi typami aktywności gruźlicy w czasie ciąży i skorelowania tych wzorców z wynikami badań łożyska.

   W tym celu kobiety chore na TBI zostaną scharakteryzowane pod kątem profili immunologicznych odzwierciedlających aktywność gruźlicy. Badania te będą opierać się na supernatantach i osadach komórkowych inkubowanych z Mtb, przy użyciu technik Luminex do analizy cytokin specyficznych dla Mtb. Wzory ekspresji RNA zostaną przeanalizowane przy użyciu sekwencjonowania wybranych uczestniczek (kobiet z TBI, kobiet z gruźlicą i kobiet z ujemnym wynikiem testu QFT), a następnie metodą qPCR ukierunkowaną na geny o różnej ekspresji od większej liczby kobiet z zakażeniem/chorobą gruźlicą i kobiet z ujemnym wynikiem testu QFT (w celu identyfikacji kobiet z różnymi rodzajami zakażenia gruźlicą, chorobą początkową i subkliniczną). Wyniki badania łożyska zostaną porównane pomiędzy tymi grupami, z uwzględnieniem innych czynników, które mogą wpływać na funkcję i rozwój łożyska.

7. Analiza przeciwciał specyficznych dla gruźlicy w supernatantach limfocytów u kobiet w ciąży z TBI w celu scharakteryzowania aktywności prątków i stadium choroby gruźliczej. W tym celu przeciwciała specyficzne dla BCG będą analizowane w supernatantach z hodowanych PBMC od kobiet z TBI. PBMC będą izolowane przy użyciu probówek do przygotowania komórek, z hodowlą na dostosowanych podłożach. Supernatanty hodowli zostaną przeanalizowane pod kątem obecności przeciwciał swoistych dla BCG, a wzorce te zostaną porównane między uczestnikami w celu rozróżnienia podgrup kobiet pod względem aktywnej lub początkowej gruźlicy (z porównaniem wzorców u kobiet z kliniczną gruźlicą i kontroli QFT-ujemnych). .