Účinky tuberkulózní infekce na vývoj a funkci placenty

Pozadí:

Tuberkulóza (TBC) je celosvětově významnou příčinou mateřské morbidity a úmrtnosti s nejvyšší zátěží v zemích s nízkými příjmy. Ve studiích založených na evropských registrech bylo těhotenství spojováno se zvýšeným výskytem onemocnění TBC, což naznačuje, že těhotenství může podporovat progresi infekce TBI (TBI). V kohortě těhotných žen žijících v Adama, velkém etiopském městě, jedna třetina účastníků měla TBI. Přesto byl výskyt onemocnění TBC během těhotenství a poporodního sledování v této kohortě relativně nízký (8 případů mezi 2000 účastnicemi během 4letého sledování). Je zajímavé, že hladiny prozánětlivých cytokinů spouštěných Mtb byly zvýšeny během pozdějších fází těhotenství, což naznačuje zvýšenou bakteriální aktivitu během těhotenství u žen s TBI. Kromě toho byly nespecifické markery systémového zánětu u těhotných žen s TBI vyšší ve srovnání s těhotnými ženami bez TBI. Je pravděpodobné, že oba tyto jevy jsou způsobeny těhotenstvím indukovanou imunitní modifikací kontroly TBC.

Důsledky těchto imunitních změn v těhotenství nebyly rozsáhle studovány. Kromě zvýšeného rizika progrese onemocnění TBC je možné, že TBI u těhotných žen může mít další nepříznivé zdravotní účinky, zejména s ohledem na výsledek těhotenství. V nedávné studii založené na registru žen žijících ve Švédsku s původem v zemích s endemickou TBC, které byly vyšetřeny na TBI v prenatální péči, bylo zjištěno, že TBI souvisí s několika typy nepříznivých výsledků těhotenství. Toto zjištění naznačuje, že TBI může ovlivnit vývoj a funkci placenty a může tak přispět ke komplikacím těhotenství. Na nepříznivých účincích infekce matky na výsledek těhotenství se může podílet několik mechanismů, včetně přímé infekce tkáně plodu a/nebo placenty, jakož i nepřímých účinků zprostředkovaných systémovým zánětem s dopadem na vývoj a funkci placenty.

Tento projekt je hloubkovou studií o souvislostech mezi TBI a TBC a placentární patologií, založená na kohortě žen s porodem v etiopských veřejných nemocnicích. Celkovým cílem je prozkoumat patologii placenty a markery dysfunkce placenty u žen s infekcí TBC a onemocněním TBC, s korelací s imunitními odpověďmi Mtb a markery mykobakteriální aktivity a charakteristikami těhotenských poruch.

Popis projektu Účastníci budou přijati a zapsáni na porodních odděleních ve dvou veřejných doporučujících nemocnicích v Addis Abeba v Etiopii. Studijní procedury budou provádět výzkumné sestry a výzkumný personál a také vyškolený kmenový personál sídlící na příslušných studijních místech. Studijní procedury budou probíhat převážně přes den ve všední dny.

Údaje o studii budou získány před porodem i po něm. Informace od účastníků studie budou shromažďovány pomocí elektronických strukturovaných dotazníků, včetně otázek na sociodemografický stav, lékařskou a porodnickou anamnézu (současná a předchozí těhotenství) a také další proměnné doporučené databází Global Pregnancy Collaboration COLLECT. Budou registrovány podrobné údaje o fyzickém stavu matky a dítěte (hmotnost, výška, obvod střední části paže, Apgar skóre), jakož i podrobnosti o porodu. Studijní data budou zadána a nahrána pomocí tabletů připojených k serveru REDCAP. Vzorky krve pro výzkumné účely budou odebrány na porodním oddělení před porodem. Před propuštěním z nemocnice budou ženy opět kontaktovány studijním personálem pro další informace o studii. V tuto chvíli účastníci také obdrží plánovaný termín 6týdenní následné návštěvy a také kontaktní údaje na studijní tým.

Ženy se symptomy nebo příznaky naznačujícími onemocnění TBC budou požádány, aby předložily dva ranní vzorky sputa pro bakteriologické vyšetření TBC. Další vyšetření budou provedena u žen s podezřením na mimoplicní TBC (v závislosti na typu projevu; např. aspirace tenkou jehlou při periferní lymfadenopatii).

O celou placentu se do 30 minut po porodu postarají pracovníci studijní patologie. Nejprve bude placenta charakterizována fyzikálně a makroskopicky podle protokolu studie založeného na doporučení Amsterdam Placental Workshop Group. Placenta bude poté uložena ve formalínu s pozdějším zalitím vybraných částí do parafínu pro histopatologické vyšetření. Kromě toho (od žen s neprovedeným těhotenstvím, které porodily v místě studie TASH) budou získány části tkáně placenty pro analýzy exprese RNA a proteinů a také pro elektronovou mikroskopii. Tyto porce budou zmraženy na suchém ledu s následným přenesením na -80°C. Ihned po porodu bude pupečníková krev odebrána do EDTA zkumavek (2-4 ml) pro následné studie transkriptomického profilu RNA.

Venózní krev bude odebírána do lithiových heparinových zkumavek (6 ml) pro následné testování QuantiFERON TB-Plus (QFT). Kromě toho bude krev odebírána do zkumavek EDTA (pro analýzy protilátek; 4-6 ml).

QFT analýza pro kategorizaci stavu TBI bude provedena do jednoho týdne po porodu. Výsledek bude sdělen účastníkům na 6týdenní následné návštěvě. Za účelem detekce subklinické TBI budou ženy s TBI v souvislosti s touto návštěvou odeslány na RTG hrudníku (bez ohledu na příznaky). Budou také požádáni, aby předložili dva ranní vzorky sputa pro bakteriologické analýzy TBC, jak je popsáno výše.

Budou sbírány výsledky rutinních testů získaných při příjmu na porodní oddělení (HIV, malárie, syfilis, diabetes, funkce ledvin, jaterní funkce, krevní obraz).

Laboratorní metody

Krev inkubovaná Mtb antigenem:

Krev bude odebrána do lithiových heparinových zkumavek a rozdělena do zkumavek QFT pro inkubaci. Po inkubaci bude krev centrifugována, aby se oddělil supernatant od buněčné pelety. QFT ELISA bude provedena podle doporučení výrobce. Zbývající supernatanty budou skladovány v alikvotech a buněčné pelety budou separovány a skladovány po přidání RNA-stabilizátoru. Mtb-inkubovaná buněčná peleta bude použita pro sekvenční analýzu exprese RNA od vybraných žen s onemocněním TBI a TBC k analýze vzorců mykobakteriální aktivity srovnáním vzorců u žen s infekcí TBC a žen s onemocněním TBC (včetně QFT-negativních kontrol ). Supernatanty inkubované s Mtb budou analyzovány na cytokiny spojené s aktivitou TBC (na základě údajů z předchozích studií o imunitní dynamice TBC během těhotenství) pomocí technologických platforem Luminex.

Neinkubovaná krev:

Venózní krev bude odebrána v EDTA zkumavkách pro analýzu Mtb-specifických protilátek.

Placenta:

Části placentární tkáně budou získány z různých částí makroskopicky normálních částí placenty. Části budou získány jak pro histopatologické (formalin), tak pro jiné studie (pro skladování v mrazáku). Všechny porce budou označeny individuálními kódy.

Metody pro konkrétní studijní cíle:

1. Porovnat histopatologii placenty u žen s a bez TBC infekce/onemocnění.

   Za tímto účelem budou řezy placenty zalité v parafínu analyzovány na různé typy patologických změn. Kromě toho bude na podskupině účastníků prováděna elektronová mikroskopie. Zkoušející budou zaslepeni vůči stavu TBI a dalším charakteristikám účastníků. Histopatologické změny budou hodnoceny. Následně bude provedeno srovnání s ohledem na stav TBI, aby se zjistilo, zda se výskyt patologických změn mezi těmito kategoriemi liší, s úpravou pro relevantní doprovodné stavy.

2. Porovnat vzorce exprese RNA ve tkáni placenty u žen s infekcí/onemocněním TBC a bez nich a korelovat tato zjištění se vzory spojenými s poruchami těhotenství a dysfunkcí placenty.

   Za tímto účelem budou analyzovány vzorce exprese RNA ve tkáni placenty od žen s infekcí/onemocněním TBC a bez ní, jakož i od žen s předem definovanými těhotenskými komplikacemi a bez nich (preeklampsie, omezení intrauterinního růstu). Účastníci tohoto studijního cíle budou vybráni z celkové kohorty na základě stavu infekce/onemocnění TBC. Aby se předešlo účinkům porodu, budou do této analýzy zahrnuti pouze účastníci s volitelným CS (neporodní placenta).

   Pro analýzu transkriptomiky RNA bude použito hromadné sekvenování. V těchto kategoriích budou určeny vzory odlišně exprimovaných genů s bioinformatickou analýzou toho, jak odlišně exprimované geny od žen s infekcí/onemocněním TBC korelují s geny u žen s poruchami těhotenství (ze studované populace a z literatury). Tyto vzorce budou také porovnány s jednotlivými výsledky těhotenství (nepříznivý výsledek, odchylky porodní hmotnosti).

3. Analyzovat expresi proteinů ve tkáni placenty u těhotných žen s TBI a bez ní a korelovat tyto vzorce s placentární patologií.

   Za tímto účelem budou charakterizovány vzorce exprese proteinů v částech nelaborované tkáně placenty s ohledem na stav infekce/choroby TBC. Analýza bude provedena pomocí hmotnostní spektrometrie. Nalezené vzorce exprese proteinů budou následně korelovány s placentární patologií a charakteristikami výsledku těhotenství.

4. Stanovit přítomnost Mtb v placentární tkáni u žen s TBI. Za tímto účelem budou zahrnuti účastníci s infekcí/onemocněním TBC (spolu s řadou kontrol s negativními výsledky QFT). Části placentární tkáně budou zkoumány metodami pro stanovení přítomnosti Mtb, včetně imunitních histochemických/in-situ hybridizačních technik a Mtb-specifických sond, které byly vyvinuty pro použití ve vzorcích parafinizované tkáně.

5. Porovnat fenotypy imunitních buněk v tkáni placenty u těhotných žen s infekcí/onemocněním TBC a bez ní a uvést tyto vzorce do vzájemného vztahu s patologií placenty.

   Za tímto účelem bude tkáň placenty zalitá v parafínu použita k identifikaci fenotypů imunitních buněk u žen s ohledem na stav TBI. K tomuto účelu budou provedeny imunohistochemické metody.

6. Analyzovat Mtb-specifickou sekreci cytokinů a vzorce exprese RNA v krvi stimulované Mtb-antigenem u žen s infekcí/onemocněním TBC za účelem vymezení skupin žen s různými typy aktivity TBC během těhotenství a korelovat tyto vzorce s nálezy placenty.

   Za tímto účelem budou ženy s TBI charakterizovány s ohledem na imunitní profily odrážející aktivitu TBI. Tyto výzkumy budou založeny na Mtb-inkubovaných supernatantech a buněčných peletách s použitím technik Luminex pro analýzu Mtb-specifických cytokinů. Vzorce exprese RNA budou analyzovány pomocí sekvenování od vybraných účastníků (ženy s TBI, ženy s onemocněním TBC a ženy negativní QFT), následované qPCR zacíleným na odlišně exprimované geny od většího počtu žen s infekcí/onemocněním TBC a QFT negativních žen (za účelem identifikace žen s různými typy TBC infekce, počínajícím a subklinickým onemocněním). Nálezy placenty budou porovnány mezi těmito skupinami s úpravou na další faktory, které mohou ovlivnit funkci a vývoj placenty.

7. Analyzovat TB-specifické protilátky v supernatantech lymfocytů u těhotných žen s TBI k charakterizaci mykobakteriální aktivity a stádia TB onemocnění Za tímto účelem budou BCG-specifické protilátky analyzovány v supernatantech z kultivovaných PBMC od žen s TBI. PBMC budou izolovány pomocí zkumavek pro přípravu buněk, s kultivací na přizpůsobeném médiu. Kultivační supernatanty budou analyzovány na přítomnost BCG-specifických protilátek a tyto vzorce budou porovnány mezi účastníky, aby se odlišily podskupiny žen s ohledem na aktivní nebo počínající TBC (s porovnáním vzorců u žen s klinickým onemocněním TBC a QFT-negativní kontroly). .