결핵 감염이 태반의 발달과 기능에 미치는 영향

배경:

결핵(TB)은 전 세계적으로 산모의 질병률과 사망률의 중요한 원인이며, 저소득 국가에서 부담이 가장 높습니다. 유럽의 등록 기반 연구에서 임신은 결핵 발병률 증가와 관련이 있으며, 이는 임신이 결핵 감염(TBI)의 진행을 촉진할 수 있음을 시사합니다. 에티오피아의 주요 도시인 아다마에 거주하는 임산부 집단에서는 참가자 중 3분의 1이 TBI를 앓고 있었습니다. 그러나 이 코호트에서 임신 및 산후 추적 기간 중 결핵 발병률은 상대적으로 낮았습니다(4년 추적 기간 동안 참가자 2,000명 중 8명). 흥미롭게도, Mtb에 의해 유발된 전염증성 사이토카인의 수준은 임신 후반기에 증가했는데, 이는 TBI가 있는 여성의 임신 중 박테리아 활동이 증가했음을 시사합니다. 또한 TBI가 있는 임산부의 비특이적 전신 염증 지표는 TBI가 없는 임산부에 비해 더 높았습니다. 이 두 현상은 임신으로 인한 결핵 통제의 면역 변형으로 인한 것일 가능성이 높습니다.

임신 중 이러한 면역 변화의 결과는 광범위하게 연구되지 않았습니다. 결핵으로의 진행 위험 증가 외에도, 임산부의 TBI는 특히 임신 결과와 관련하여 건강에 다른 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 산전 관리에서 TBI 검사를 받은 결핵 발병 국가 출신의 스웨덴에 거주하는 여성을 대상으로 한 최근 등록 기반 연구에서 TBI는 여러 유형의 부정적인 임신 결과와 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이 발견은 TBI가 태반의 발달과 기능에 영향을 미쳐 임신 합병증에 기여할 수 있음을 시사합니다. 태아 및/또는 태반 조직의 직접적인 감염뿐만 아니라 태반 발달 및 기능에 영향을 미치는 전신 염증에 의해 매개되는 간접적인 영향을 포함하여 임신 결과에 대한 산모 감염의 부작용에 여러 메커니즘이 관여할 수 있습니다.

이 프로젝트는 에티오피아 공립병원에서 출산한 여성 집단을 기반으로 TBI와 결핵 질환 및 태반 병리 사이의 연관성에 대한 심층 연구입니다. 전반적인 목적은 Mtb 면역 반응, 마이코박테리아 활성 지표 및 임신 장애의 특징과의 상관관계를 바탕으로 결핵 감염 및 결핵 질환이 있는 여성의 태반 병리 및 태반 기능 장애 지표를 조사하는 것입니다.

프로젝트 설명 참가자는 에티오피아 아디스 아베바에 있는 두 공공 위탁 병원의 노동 병동에서 모집 및 등록됩니다. 연구 절차는 연구 간호사 및 연구 직원뿐만 아니라 각 연구 현장에 기반을 둔 훈련된 정규 직원에 의해 수행됩니다. 학습절차는 주로 평일 낮 시간에 진행됩니다.

연구 데이터는 전달 전과 전달 후에 수집됩니다. 연구 참가자의 정보는 사회 인구통계학적 상태, 의료 및 산과 병력(현재 및 이전 임신), Global Pregnancy Collaboration COLLECT 데이터베이스에서 권장하는 기타 변수에 대한 질문을 포함하여 구조화된 전자 설문지를 사용하여 수집됩니다. 산모와 영아의 신체상태(체중, 키, 상박중간둘레, 아프가 점수)에 대한 상세 데이터와 분만 내역이 등록됩니다. 연구 데이터는 REDCAP 서버에 연결된 태블릿을 사용하여 입력되고 업로드됩니다. 연구 목적의 혈액 샘플은 출산 전에 분만실에서 채취됩니다. 병원에서 퇴원하기 전에 연구에 대한 추가 정보를 얻기 위해 연구 직원이 여성에게 다시 연락할 것입니다. 이때 참가자에게는 6주간의 후속 방문 일정과 연구팀의 연락처 정보도 제공됩니다.

결핵 질환을 암시하는 증상이나 징후가 있는 여성은 세균학적 결핵 조사를 위해 아침 가래 샘플 2개를 제출해야 합니다. 폐외 결핵이 의심되는 여성에 대해서는 다른 조사가 수행될 것입니다(발현 유형에 따라 다름, 예를 들어 말초 림프절병증의 경우 미세 바늘 흡인).

전체 태반은 연구 병리학 직원이 분만 후 30분 이내에 관리합니다. 첫째, 태반은 암스테르담 태반 워크숍 그룹(Amsterdam Placental Workshop Group)의 권장 사항을 기반으로 한 연구 프로토콜에 따라 물리적 및 거시적으로 특성화됩니다. 태반은 포르말린에 보관되며 나중에 조직병리학적 조사를 위해 선택된 부분을 파라핀에 삽입합니다. 또한(TASH 연구 현장에서 출산한 미진통 임신 여성으로부터) 태반 조직의 일부를 RNA 및 단백질 발현 분석과 전자 현미경 검사를 위해 채취합니다. 이 부분은 드라이아이스에서 냉동시킨 후 -80°C로 옮깁니다. 전달 직후, RNA 전사체 프로필에 대한 후속 연구를 위해 제대혈을 EDTA 튜브(2-4ml)에 수집합니다.

후속 QuantiFERON TB-Plus(QFT) 테스트를 위해 정맥혈을 리튬 헤파린 튜브(6ml)에 수집합니다. 또한 혈액은 EDTA 튜브(항체 분석용, 4~6ml)에 수집됩니다.

TBI 상태 분류를 위한 QFT 분석은 배송 후 1주일 이내에 수행됩니다. 결과는 6주간의 후속 방문 시 참가자들에게 전달될 것입니다. 무증상 결핵을 발견하기 위해, TBI가 있는 여성은 이번 방문과 관련하여 (증상과 관계없이) 흉부 엑스레이를 의뢰받게 됩니다. 또한 위에서 설명한 대로 세균학적 결핵 분석을 위해 아침 객담 샘플 2개를 제출하도록 요청받을 것입니다.

분만실 입원 시 얻은 일상적인 검사 결과(HIV, 말라리아, 매독, 당뇨병, 신장 기능, 간 기능, 혈구 수치)가 수집됩니다.

실험실 방법

Mtb 항원 배양 혈액:

혈액은 리튬 헤파린 튜브에 수집되고 배양을 위해 QFT 튜브로 분리됩니다. 배양 후 혈액을 원심분리하여 세포 펠릿에서 상층액을 분리합니다. QFT ELISA는 제조업체의 권장 사항에 따라 수행됩니다. 남은 상청액은 분취액으로 저장되며, 세포 펠릿은 RNA 안정제를 첨가한 후 분리되어 보관됩니다. Mtb 배양 세포 펠렛은 결핵 감염 여성과 결핵 질환 여성의 패턴을 비교하여 마이코박테리아 활동 패턴을 분석하기 위해 선택된 TBI 및 결핵 질환 여성의 RNA 발현에 대한 서열 기반 분석에 사용됩니다(QFT 음성 대조군 포함). ). Mtb 배양 상청액은 Luminex 기술 플랫폼을 사용하여 결핵 활동과 관련된 사이토카인(임신 중 결핵 면역 역학에 대한 이전 연구의 데이터를 기반으로 함)에 대해 분석됩니다.

배양되지 않은 혈액:

Mtb-특이적 항체 분석을 위해 EDTA 튜브에서 정맥혈을 채취합니다.

태반:

태반 조직의 일부는 태반의 거시적으로 정상적인 부분의 다른 부분에서 얻어집니다. 조직병리학적(포르말린) 및 기타 연구(냉동고 보관용)를 위해 일부를 확보합니다. 모든 부분에는 개별 코드가 표시됩니다.

특정 연구 목표를 위한 방법:

1. 결핵 감염/질병이 있는 여성과 없는 여성의 태반 조직병리학을 비교합니다.

   이를 위해 파라핀 포매 태반 부분을 분석하여 다양한 유형의 병리학적 변화를 확인합니다. 또한 일부 참가자를 대상으로 전자현미경 검사가 실시됩니다. 시험관은 참가자의 TBI 상태 및 기타 특성을 알 수 없습니다. 조직병리학적 변화가 기록될 것이다. 이어서, TBI 상태에 대한 비교를 수행하여 병리학적 변화의 발생이 이러한 범주 간에 다른지 여부를 결정하고 관련 수반되는 조건을 조정합니다.

2. 결핵 감염/질병이 있는 여성과 없는 여성의 태반 조직에서 RNA 발현 패턴을 비교하고 이러한 발견을 임신 장애 및 태반 기능 장애와 관련된 패턴과 연관시키는 것입니다.

   이 목적을 위해, 결핵 감염/질병이 있거나 없는 여성, 미리 정의된 임신 합병증(자간전증, 자궁 내 성장 제한)이 있거나 없는 여성의 태반 조직에서 RNA 발현 패턴을 분석합니다. 본 연구 목표에 대한 참가자는 결핵 감염/질병 상태를 기준으로 전체 코호트에서 선택됩니다. 진통으로 인한 영향을 피하기 위해 선택적 CS가 있는 참가자만 이 분석에 포함됩니다(진통되지 않은 태반).

   대량 시퀀싱은 RNA 전사체학 분석에 사용됩니다. 차별적으로 발현되는 유전자의 패턴은 결핵 감염/질병이 있는 여성의 차별적으로 발현되는 유전자가 임신 장애가 있는 여성의 유전자와 어떻게 상관관계가 있는지에 대한 생물정보학적 분석을 통해 이러한 범주에서 결정됩니다(연구 집단 및 문헌에서). 이러한 패턴은 개별 임신 결과(불리한 결과, 출생 체중 편차)와도 비교됩니다.

3. TBI가 있거나 없는 임산부의 태반 조직에서 단백질 발현을 분석하고 이러한 패턴을 태반 병리와 연관시키는 것입니다.

   이 목적을 위해, 노동되지 않은 태반 조직 부분의 단백질 발현 패턴을 결핵 감염/질병 상태와 관련하여 특성화할 것입니다. 분석은 질량 분석법을 사용하여 수행됩니다. 발견된 단백질 발현 패턴은 이후 태반 병리 및 임신 결과 특성과 상관관계가 있을 것입니다.

4. TBI가 있는 여성의 태반 조직에서 Mtb의 존재를 확인합니다. 이 목표를 위해 결핵 감염/질병이 있는 참가자가 포함됩니다(QFT 결과가 음성인 여러 대조군과 함께). 면역 조직화학/계내 혼성화 기술 및 파라핀화된 조직 샘플에 사용하기 위해 개발된 Mtb 특이적 프로브를 포함하여 Mtb의 존재를 확인하는 방법을 사용하여 태반 조직의 일부를 조사합니다.

5. 결핵 감염/질병이 있거나 없는 임산부의 태반 조직의 면역 세포 표현형을 비교하고 이러한 패턴을 태반 병리와 연관시키는 것입니다.

   이 목적을 위해 파라핀 포매 태반 조직을 사용하여 TBI 상태와 관련하여 여성의 면역 세포 표현형을 식별합니다. 이 목적을 위해 면역조직화학 방법이 수행됩니다.

6. 결핵 감염/질병이 있는 여성의 Mtb 항원 자극 혈액에서 Mtb 특이적 사이토카인 분비 및 RNA 발현 패턴을 분석하여 임신 중 다양한 유형의 결핵 활동을 보이는 여성 그룹을 묘사하고 이러한 패턴을 태반 소견과 연관시키는 것입니다.

   이 목적을 위해, TBI를 앓고 있는 여성은 결핵 활동을 반영하는 면역 프로필과 관련하여 특성화될 것입니다. 이러한 조사는 Mtb 특이적 사이토카인 분석을 위해 Luminex 기술을 사용하여 Mtb 배양 상청액 및 세포 펠릿을 기반으로 합니다. 선택된 참가자(TBI 여성, 결핵 여성 및 QFT 음성 여성)의 시퀀싱을 사용하여 RNA 발현 패턴을 분석한 후, 결핵 감염/질병이 있는 더 많은 여성 및 QFT 음성 여성의 차별적으로 발현된 유전자를 표적으로 하는 qPCR이 뒤따릅니다. (다양한 유형의 결핵 감염, 초기 및 무증상 질환이 있는 여성을 식별하기 위해). 태반 기능 및 발달에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인을 조정하여 태반 소견을 이들 그룹 간에 비교합니다.

7. 마이코박테리아 활성 및 결핵 질환 단계를 특성화하기 위해 TBI가 있는 임산부의 림프구 상층액에서 결핵 특이적 항체를 분석하려면 이 목적을 위해 TBI가 있는 여성의 배양된 PBMC의 상층액에서 BCG 특이적 항체를 분석합니다. PBMC는 적응된 배지에서 배양하면서 세포 준비 튜브를 사용하여 분리됩니다. 배양 상청액을 분석하여 BCG 특이적 항체의 존재를 확인하고 이러한 패턴을 참가자 간에 비교하여 활동성 또는 초기 결핵과 관련하여 여성의 하위 집합을 구별합니다(임상 결핵 질환이 있는 여성과 QFT 음성 대조군의 패턴 비교). .