Effekter av tuberkulosinfektion på utveckling och funktion av placentan

Bakgrund:

Tuberkulos (TB) är en viktig orsak till mödrasjuklighet och mortalitet globalt, med den högsta bördan i låginkomstländer. Graviditet har associerats med ökad förekomst av TB-sjukdom i registerbaserade studier från Europa, vilket tyder på att graviditet kan främja progression av TB-infektion (TBI). I en kohort av gravida kvinnor som bor i Adama, en storstad i Etiopien, hade en tredjedel av deltagarna TBI. Ändå var förekomsten av TB-sjukdom under graviditet och post-partum uppföljning i denna kohort relativt låg (8 fall bland 2000 deltagare under 4 års uppföljning). Intressant nog var nivåerna av Mtb-utlösta pro-inflammatoriska cytokiner förhöjda under senare stadier av graviditeten, vilket tyder på ökad bakteriell aktivitet under graviditeten hos kvinnor med TBI. Dessutom var icke-specifika systemiska inflammationsmarkörer hos gravida kvinnor med TBI högre jämfört med gravida kvinnor utan TBI. Det är troligt att båda dessa fenomen beror på graviditetsinducerad immunförändring av TB-kontroll.

Konsekvenserna av dessa immunförändringar under graviditeten har inte studerats i detalj. Förutom ökad risk för progression till TB-sjukdom är det möjligt att TBI hos gravida kvinnor kan ha andra negativa hälsoeffekter, särskilt med hänsyn till graviditetsresultatet. I en nyligen genomförd registerbaserad studie av kvinnor som bor i Sverige med ursprung i TB-endemiska länder som screenats för TBI inom mödravården visade sig TBI vara associerat med flera typer av negativa graviditetsutfall. Detta fynd tyder på att TBI kan påverka utvecklingen och funktionen av moderkakan, och därmed kan bidra till graviditetskomplikationer. Flera mekanismer kan vara involverade i negativa effekter av moderns infektion på graviditetsresultatet, inklusive direkt infektion av foster- och/eller placentavävnad, såväl som indirekta effekter medierade av systemisk inflammation med inverkan på placentautveckling och funktion.

Detta projekt är en djupgående studie om sambanden mellan TBI och TB-sjukdom och placentapatologi, baserat på en kohort av kvinnor med förlossning vid etiopiska offentliga sjukhus. Det övergripande målet är att undersöka placentala patologi och markörer för placenta dysfunktion hos kvinnor med TB-infektion och TB-sjukdom, med korrelation till Mtb-immunsvar och markörer för mykobakteriell aktivitet och till egenskaper hos graviditetsstörningar.

Projektbeskrivning Deltagare kommer att rekryteras och skrivas in på förlossningsavdelningar på två offentliga remisssjukhus i Addis Abeba, Etiopien. Studieprocedurer kommer att utföras av forskningssjuksköterskor och forskningspersonal, samt av utbildad ordinarie personal baserad på respektive studieplats. Studieförfaranden kommer huvudsakligen att genomföras dagtid under vardagar.

Studiedata kommer att erhållas före såväl som efter leverans. Information från studiedeltagare kommer att samlas in med hjälp av elektroniska strukturerade frågeformulär, inklusive frågor om sociodemografiskt tillstånd, medicinsk och obstetrisk historia (nuvarande och tidigare graviditeter), samt andra variabler som rekommenderas av databasen Global Pregnancy Collaboration COLLECT. Detaljerade uppgifter om moderns och spädbarns fysiska status (vikt, längd, mitten av överarmens omkrets, Apgar-poäng), samt leveransdetaljer, kommer att registreras. Studiedata kommer att matas in och laddas upp med surfplattor anslutna till en REDCAP-server. Blodprover för forskningsändamål kommer att tas på förlossningsavdelningen före förlossningen. Före utskrivning från sjukhus kommer kvinnor återigen att kontaktas av studiepersonal för ytterligare information om studien. Vid denna tidpunkt kommer deltagarna också att få ett planerat datum för det 6 veckor långa uppföljningsbesöket, samt kontaktuppgifter till studieteamet.

Kvinnor med symtom eller tecken som tyder på TB-sjukdom kommer att uppmanas att lämna in två morgonsputumprover för bakteriologiska TB-undersökningar. Andra undersökningar kommer att utföras på kvinnor med misstänkt extrapulmonell TB (beroende på typ av presentation; till exempel finnålsaspiration vid perifer lymfadenopati).

Hela moderkakan kommer att tas om hand inom 30 minuter efter förlossningen av studiepatologipersonal. Först kommer placentan att karakteriseras fysiskt och makroskopiskt enligt ett studieprotokoll baserat på rekommendationerna från Amsterdam Placental Workshop Group. Placentan kommer sedan att lagras i formalin, med senare inbäddning av utvalda delar i paraffin för histopatologiska undersökningar. Dessutom (från kvinnor med obearbetad graviditet som förlossar vid TASH-studieplatsen) kommer delar av placentavävnad att erhållas för RNA- och proteinuttrycksanalyser, såväl som för elektronmikroskopi. Dessa portioner kommer att frysas på torris, med efterföljande överföring till -80°C. Direkt efter leverans kommer navelsträngsblod att samlas in i EDTA-rör (2-4 ml) för efterföljande studier av RNA-transkriptomisk profil.

Venöst blod kommer att samlas in i litiumheparinrör (6 ml) för efterföljande QuantiFERON TB-Plus (QFT)-testning. Dessutom kommer blod att samlas in i EDTA-rör (för antikroppsanalyser; 4-6 ml).

QFT-analys för kategorisering av TBI-status kommer att utföras inom en vecka efter leverans. Resultatet kommer att meddelas deltagarna vid det 6 veckor långa uppföljningsbesöket. För att upptäcka subklinisk TB kommer kvinnor med TBI att remitteras till lungröntgen (oavsett symtom) i samband med detta besök. De kommer också att uppmanas att lämna in två morgonsputumprover för bakteriologiska tuberkulosanalyser enligt beskrivningen ovan.

Resultat från rutinprov som erhållits vid inläggning på förlossningsavdelningen kommer att samlas in (hiv, malaria, syfilis, diabetes, njurfunktion, leverfunktion, blodvärde).

Laboratoriemetoder

Mtb antigen-inkuberat blod:

Blod kommer att samlas upp i litiumheparinrör och separeras i QFT-rör för inkubation. Efter inkubation kommer blod att centrifugeras för att separera supernatanten från cellpelleten. QFT ELISA kommer att utföras enligt tillverkarens rekommendationer. Återstående supernatanter kommer att lagras i alikvoter, och cellpellets kommer att separeras och lagras efter tillsats av RNA-stabilisator. Den Mtb-inkuberade cellpelleten kommer att användas för sekvensbaserad analys av RNA-uttryck från utvalda kvinnor med TBI och TB-sjukdom för att analysera mykobakteriella aktivitetsmönster genom jämförelse av mönster hos kvinnor med TB-infektion och de med TB-sjukdom (inklusive QFT-negativa kontroller ). Mtb-inkuberade supernatanter kommer att analyseras för cytokiner kopplade till TB-aktivitet (baserat på data från tidigare studier om TB-immundynamik under graviditet), med hjälp av Luminex teknologiplattformar.

Oinkuberat blod:

Venöst blod kommer att tas i EDTA-rör för analys av Mtb-specifika antikroppar.

Placenta:

Delar av placentavävnad kommer att erhållas från olika delar av makroskopiskt normala delar av placentan. Portioner kommer att erhållas både för histopatologiska (formalin) och andra studier (för frysförvaring). Alla portioner kommer att märkas med individuella koder.

Metoder för specifika studiemål:

1. Att jämföra placentahistopatologi hos kvinnor med och utan TB-infektion/sjukdom.

   För detta syfte kommer sektioner av paraffininbäddad placenta att analyseras för olika typer av patologiska förändringar. Dessutom kommer elektronmikroskopi att genomföras från en undergrupp av deltagare. Examinatorer kommer att bli blinda för TBI-status och andra egenskaper hos deltagarna. De histopatologiska förändringarna kommer att bedömas. Därefter kommer jämförelse med avseende på TBI-status att göras för att avgöra om förekomsten av patologiska förändringar skiljer sig mellan dessa kategorier, med justering för relevanta samtidiga tillstånd.

2. Att jämföra RNA-uttrycksmönster i placentavävnad hos kvinnor med och utan TB-infektion/sjukdom, och att korrelera dessa fynd med mönster associerade med graviditetsstörningar och placenta dysfunktion.

   För detta syfte kommer RNA-expressionsmönster att analyseras i placentavävnad från kvinnor med och utan TB-infektion/sjukdom, samt från kvinnor med och utan fördefinierade graviditetskomplikationer (preeklampsi, intrauterin tillväxtrestriktion). Deltagare för detta studiemål kommer att väljas från den totala kohorten, baserat på TB-infektion/sjukdomsstatus. För att undvika effekter från förlossningen kommer endast deltagare med elektiv CS att inkluderas i denna analys (oarbetad placenta).

   Bulksekvensering kommer att användas för analys av RNA-transkriptomik. Mönster för differentiellt uttryckta gener kommer att bestämmas i dessa kategorier, med bioinformatisk analys av hur differentiellt uttryckta gener från kvinnor med TB-infektion/sjukdom korrelerar med de hos kvinnor med graviditetsstörningar (från studiepopulationen och från litteratur). Dessa mönster kommer också att jämföras med individuella graviditetsutfall (ogynnsamt utfall, födelseviktsavvikelser).

3. Att analysera proteinuttryck i placentavävnad hos gravida kvinnor med och utan TBI, och att korrelera dessa mönster med placentapatologi.

   För detta syfte kommer proteinuttrycksmönster i delar av oparbetad placentavävnad att karakteriseras med hänsyn till TB-infektion/sjukdomsstatus. Analys kommer att göras med hjälp av masspektrometri. Proteinexpressionsmönstren som hittas kommer därefter att korreleras till placentapatologi och till graviditetsresultategenskaper.

4. För att fastställa förekomsten av Mtb i placentavävnad hos kvinnor med TBI. För detta syfte kommer deltagare med TB-infektion/-sjukdom att inkluderas (tillsammans med ett antal kontroller med negativa QFT-resultat). Delar av placentavävnad kommer att undersökas med metoder för att bestämma närvaron av Mtb, inklusive immunhistokemi/hybridiseringstekniker på plats och Mtb-specifika prober som har utvecklats för användning i paraffiniserade vävnadsprover.

5. Att jämföra immuncellsfenotyper i placentavävnad hos gravida kvinnor med och utan TB-infektion/sjukdom, och att korrelera dessa mönster med placentapatologi.

   För detta syfte kommer paraffininbäddad placentavävnad att användas för att identifiera immuncellsfenotyper hos kvinnor med avseende på TBI-status. Immunhistokemi kommer att utföras för detta ändamål.

6. Att analysera Mtb-specifik cytokinutsöndring och RNA-uttrycksmönster i Mtb-antigenstimulerat blod hos kvinnor med TB-infektion/sjukdom för att avgränsa grupper av kvinnor med olika typer av TB-aktivitet under graviditeten, och att korrelera dessa mönster med placentafynd.

   För detta syfte kommer kvinnor med TBI att karakteriseras med avseende på immunprofiler som återspeglar TB-aktivitet. Dessa undersökningar kommer att baseras på Mtb-inkuberade supernatanter och cellpellets, med Luminex-tekniker för analys av Mtb-specifika cytokiner. RNA-expressionsmönster kommer att analyseras med hjälp av sekvensering från utvalda deltagare (kvinnor med TBI, kvinnor med TB-sjukdom och QFT-negativa kvinnor), följt av qPCR som riktar sig mot differentiellt uttryckta gener från ett större antal kvinnor med TB-infektion/sjukdom och QFT-negativa kvinnor (för att identifiera kvinnor med olika typer av tuberkulosinfektion, begynnande och subklinisk sjukdom). Fynden från placenta kommer att jämföras mellan dessa grupper, med justering för andra faktorer som kan påverka placentafunktion och utveckling.

7. Att analysera TB-specifika antikroppar i lymfocytsupernatanter hos gravida kvinnor med TBI för att karakterisera mykobakteriell aktivitet och TB-sjukdomsstadium. För detta syfte kommer BCG-specifika antikroppar att analyseras i supernatanter från odlade PBMC från kvinnor med TBI. PBMCs kommer att isoleras med hjälp av cellpreparationsrör, med odling på anpassat medium. Kultursupernatanter kommer att analyseras för närvaro av BCG-specifika antikroppar, och dessa mönster kommer att jämföras mellan deltagare för att särskilja undergrupper av kvinnor med avseende på aktiv eller begynnande TB (med jämförelse av mönster hos kvinnor med klinisk TB-sjukdom och QFT-negativa kontroller) .