Tuberkuloosiinfektion vaikutukset istukan kehitykseen ja toimintaan

Tausta:

Tuberkuloosi (TB) on tärkeä äitien sairastuvuuden ja kuolleisuuden syy maailmanlaajuisesti, ja se on suurin taakka matalan tulotason maissa. Euroopassa tehdyissä rekisteripohjaisissa tutkimuksissa raskaus on yhdistetty tuberkuloosin lisääntyneeseen ilmaantuvuuteen, mikä viittaa siihen, että raskaus voi edistää tuberkuloosiinfektion (TBI) etenemistä. Adamassa, suuressa Etiopian kaupungissa, asuvassa raskaana olevien naisten kohortissa kolmanneksella osallistujista oli TBI. Silti tuberkuloosin ilmaantuvuus raskauden ja synnytyksen jälkeisen seurannan aikana tässä kohortissa oli suhteellisen alhainen (8 tapausta 2000 osallistujan joukossa 4 vuoden seurannan aikana). Mielenkiintoista on, että Mtb:n laukaisemien pro-inflammatoristen sytokiinien tasot nousivat raskauden myöhemmissä vaiheissa, mikä viittaa lisääntyneeseen bakteeriaktiivisuuteen raskauden aikana naisilla, joilla on TBI. Lisäksi epäspesifiset systeemiset tulehdusmarkkerit raskaana olevilla naisilla, joilla oli TBI, olivat korkeampia kuin raskaana olevilla naisilla, joilla ei ollut TBI:tä. On todennäköistä, että nämä molemmat ilmiöt johtuvat raskauden aiheuttamasta tuberkuloosin hallinnan immuunimuuntelusta.

Näiden immuunimuutosten seurauksia raskauden aikana ei ole tutkittu laajasti. Tuberkuloositaudiksi etenemisen lisääntyneen riskin lisäksi on mahdollista, että raskaana olevien naisten TBI:llä voi olla muita haitallisia terveysvaikutuksia, erityisesti mitä tulee raskauden lopputulokseen. Äskettäin tehdyssä rekisteripohjaisessa tutkimuksessa naisilla, jotka asuvat Ruotsissa ja olivat syntyneet tuberkuloosin endeemisistä maista, ja jotka seulottiin TBI:n varalta synnytyksen hoidossa, TBI:n havaittiin liittyvän useisiin haitallisiin raskaustuloksiin. Tämä havainto viittaa siihen, että TBI saattaa vaikuttaa istukan kehitykseen ja toimintaan ja siten edistää raskauden komplikaatioita. Useat mekanismit voivat liittyä äidin infektion haitallisiin vaikutuksiin raskauden lopputulokseen, mukaan lukien sikiön ja/tai istukan kudoksen suora infektio sekä systeemisen tulehduksen välittämät epäsuorat vaikutukset, jotka vaikuttavat istukan kehitykseen ja toimintaan.

Tämä projekti on syvällinen tutkimus TBI:n ja tuberkuloosin sekä istukan patologian välisistä yhteyksistä, joka perustuu Etiopian julkisissa sairaaloissa synnyttäneiden naisten kohorttiin. Yleisenä tavoitteena on tutkia istukan patologiaa ja istukan toimintahäiriön markkereita tuberkuloosi- ja tuberkuloositautia sairastavilla naisilla korrelaatiolla Mtb-immuunivasteisiin ja mykobakteeriaktiivisuuden markkereihin sekä raskaushäiriöiden ominaisuuksiin.

Hankkeen kuvaus Osallistujat rekrytoidaan ja rekisteröidään kahden julkisen lähetesairaalan työosastoille Addis Abebassa, Etiopiassa. Tutkimustoimenpiteet suorittavat tutkimussairaanhoitajat ja tutkimushenkilöstö sekä koulutettu vakituinen henkilökunta vastaavilla tutkimuskohteilla. Opintojaksot suoritetaan pääsääntöisesti päiväsaikaan arkipäivisin.

Tutkimustiedot saadaan ennen synnytystä ja sen jälkeen. Tutkimukseen osallistujilta kerätään tietoa sähköisillä strukturoiduilla kyselylomakkeilla, mukaan lukien kysymykset sosio-demografisesta tilasta, lääketieteellisestä ja synnytyshistoriasta (nykyiset ja aiemmat raskaudet) sekä muita Global Pregnancy Collaboration COLLECT -tietokannan suosittelemia muuttujia. Yksityiskohtaiset tiedot äidin ja vauvan fyysisestä tilasta (paino, pituus, olkavarren ympärysmitta, Apgar-pisteet) sekä toimitustiedot rekisteröidään. Tutkimustiedot syötetään ja ladataan REDCAP-palvelimeen kytkettyjen tablettien avulla. Verinäytteet tutkimustarkoituksiin otetaan synnytysosastolla ennen synnytystä. Ennen sairaalasta kotiutumista tutkimushenkilökunta ottaa uudelleen yhteyttä naisiin lisätietojen saamiseksi tutkimuksesta. Tällä hetkellä osallistujat saavat myös suunnitellun päivämäärän 6 viikon seurantakäynnille sekä tutkimusryhmän yhteystiedot.

Naisia, joilla on tuberkuloosiin viittaavia oireita tai merkkejä, pyydetään toimittamaan kaksi aamulla yskösnäytettä bakteriologiseen tuberkuloositutkimukseen. Muita tutkimuksia tehdään naisille, joilla epäillään ekstrapulmonaalista tuberkuloosia (riippuen ilmentymisen tyypistä; esimerkiksi ohuen neulan aspiraatio perifeerisen lymfadenopatian tapauksessa).

Tutkimuspatologian henkilökunta hoitaa koko istukan 30 minuutin kuluessa synnytyksestä. Ensin istukka karakterisoidaan fyysisesti ja makroskooppisesti Amsterdamin istukkatyöpajaryhmän suositusten mukaisen tutkimusprotokollan mukaisesti. Istukka varastoidaan sitten formaliiniin, jolloin valitut osat upotetaan myöhemmin parafiiniin histopatologisia tutkimuksia varten. Lisäksi (työttömänä raskaana olevilta naisilta, jotka synnyttävät TASH-tutkimuspaikalla) otetaan osia istukan kudoksesta RNA- ja proteiiniekspressioanalyysejä sekä elektronimikroskopiaa varten. Nämä osat pakastetaan kuivajäällä, minkä jälkeen ne siirretään -80 °C:seen. Heti toimituksen jälkeen napanuoraveri kerätään EDTA-putkiin (2-4 ml) myöhempiä RNA:n transkriptioprofiilin tutkimuksia varten.

Laskimoveri kerätään litiumhepariiniputkiin (6 ml) myöhempää QuantiFERON TB-Plus (QFT) -testiä varten. Lisäksi veri kerätään EDTA-putkiin (vasta-aineanalyysejä varten; 4-6 ml).

QFT-analyysi TBI-tilan luokittelua varten suoritetaan viikon kuluessa synnytyksestä. Tulos ilmoitetaan osallistujille 6 viikon seurantakäynnillä. Subkliinisen tuberkuloosin havaitsemiseksi TBI-potilaat ohjataan rintakehän röntgeniin (oireista riippumatta) tämän käynnin yhteydessä. Heitä pyydetään myös toimittamaan kaksi aamulla otettua yskösnäytettä bakteriologista tuberkuloosianalyysiä varten edellä kuvatulla tavalla.

Synnytysosaston vastaanotolla saatujen rutiinitutkimusten tulokset kerätään (HIV, malaria, kuppa, diabetes, munuaisten toiminta, maksan toiminta, verenkuva).

Laboratoriomenetelmät

Mtb-antigeenillä inkuboitu veri:

Veri kerätään litiumhepariiniputkiin ja erotetaan QFT-putkiin inkubaatiota varten. Inkuboinnin jälkeen veri sentrifugoidaan supernatantin erottamiseksi solupelletistä. QFT ELISA suoritetaan valmistajan suosituksen mukaisesti. Jäljelle jääneet supernatantit varastoidaan erissä, ja solupelletit erotetaan ja säilytetään RNA-stabilisaattorin lisäämisen jälkeen. Mtb-inkuboitua solupellettiä käytetään sekvenssipohjaiseen analyysiin RNA:n ilmentymisestä valituilta naisilta, joilla on TBI- ja tuberkuloositauti, jotta voidaan analysoida mykobakteeriaktiivisuusmalleja vertaamalla TB-infektiota sairastavien ja tuberkuloosia sairastavien naisten kuvioita (mukaan lukien QFT-negatiiviset kontrollit). ). Mtb-inkuboidut supernatantit analysoidaan TB-aktiivisuuteen liittyvien sytokiinien varalta (perustuu aiemmista tutkimuksista tuberkuloosin immuunidynamiikasta raskauden aikana) Luminex-teknologiaalustoilla.

Haudontamaton veri:

Laskimoveri otetaan EDTA-putkiin Mtb-spesifisten vasta-aineiden analysointia varten.

Istukka:

Osia istukan kudosta saadaan makroskooppisesti normaaleista istukan osista. Annokset hankitaan sekä histopatologisia (formaliini) että muita tutkimuksia varten (pakastin säilytystä varten). Kaikki annokset merkitään yksilöllisillä koodeilla.

Menetelmät tiettyjä tutkimustavoitteita varten:

1. Vertaa istukan histopatologiaa naisilla, joilla on tuberkuloosiinfektio/sairaus tai ei.

   Tätä tarkoitusta varten parafiiniin upotetun istukan leikkeet analysoidaan erityyppisten patologisten muutosten varalta. Lisäksi osalta osallistujia tehdään elektronimikroskopia. Tutkijat ovat sokeita TBI-tilan ja muiden osallistujien ominaisuuksien suhteen. Histopatologiset muutokset pisteytetään. Tämän jälkeen suoritetaan TBI-tilan vertailu sen määrittämiseksi, eroaako patologisten muutosten esiintyminen näiden luokkien välillä, mukauttamalla asiaankuuluvat samanaikaiset tilat.

2. Vertaa RNA-ilmentymismalleja istukan kudoksessa naisilla, joilla on tuberkuloosiinfektio/sairaus ja ilman niitä, ja korreloida nämä löydökset raskaushäiriöihin ja istukan toimintahäiriöihin liittyviin malleihin.

   Tätä tarkoitusta varten RNA-ilmentymismalleja analysoidaan istukan kudoksessa naisilta, joilla on tuberkuloosiinfektio/sairaus ja joilla ei ole niitä, sekä naisilta, joilla on ennalta määriteltyjä raskauskomplikaatioita (preeklampsia, kohdunsisäinen kasvun rajoitus). Osallistujat tähän tutkimustavoitteeseen valitaan koko kohortista tuberkuloositartunnan/sairauden tilan perusteella. Synnytyksen aiheuttamien vaikutusten välttämiseksi tähän analyysiin otetaan vain osallistujat, joilla on elektiivinen CS (työtön istukka).

   Bulkkisekvensointia käytetään RNA-transkriptomiikan analysointiin. Erilaisesti ilmentyneiden geenien kuviot määritetään näissä luokissa bioinformaattisen analyysin avulla siitä, kuinka tuberkuloositartuntaa/-sairautta sairastavien naisten erilailla ilmentyneet geenit korreloivat raskaushäiriöitä sairastavien naisten geenien kanssa (tutkimuspopulaatiosta ja kirjallisuudesta). Näitä malleja verrataan myös yksittäisiin raskauden tuloksiin (haitallinen tulos, syntymäpainon poikkeamat).

3. Analysoida proteiinin ilmentyminen istukan kudoksessa raskaana olevilla naisilla, joilla on TBI ja ilman, ja korreloida nämä mallit istukan patologian kanssa.

   Tätä tarkoitusta varten proteiinin ilmentymismallit työstämättömän istukan kudoksen osissa karakterisoidaan TB-infektion/sairauden tilan suhteen. Analyysi tehdään massaspektrometrialla. Löydetyt proteiinin ilmentymismallit korreloivat myöhemmin istukan patologian ja raskauden tulosominaisuuksien kanssa.

4. Mtb:n esiintymisen määrittäminen istukan kudoksessa naisilla, joilla on TBI. Tätä tarkoitusta varten osallistujat, joilla on TB-infektio/sairaus, otetaan mukaan (sekä useat kontrollit, joiden QFT-tulokset ovat negatiivisia). Osia istukan kudoksesta tutkitaan menetelmillä Mtb:n läsnäolon määrittämiseksi, mukaan lukien immuunihistokemia/in situ -hybridisaatiotekniikat ja Mtb-spesifiset koettimet, jotka on kehitetty käytettäviksi parafinoiduissa kudosnäytteissä.

5. Vertaa immuunisolufenotyyppejä istukan kudoksessa raskaana olevilla naisilla, joilla on tuberkuloosi-infektio/sairaus ja ilman niitä, ja korreloida nämä kuviot istukan patologian kanssa.

   Tätä tarkoitusta varten parafiiniin upotettua istukan kudosta käytetään tunnistamaan immuunisolufenotyypit naisilla TBI-tilan suhteen. Tätä tarkoitusta varten suoritetaan immunohistokemiallisia menetelmiä.

6. Analysoida Mtb-spesifisiä sytokiinierityksen ja RNA:n ilmentymismalleja Mtb-antigeenin stimuloimassa veressä naisilla, joilla on TB-infektio/sairaus, jotta voidaan rajata naisten ryhmiä, joilla on erityyppistä tuberkuloosiaktiivisuutta raskauden aikana, ja korreloida nämä kuviot istukan löydöksiin.

   Tätä tarkoitusta varten TBI:tä sairastavat naiset karakterisoidaan tuberkuloosiaktiivisuutta heijastavien immuuniprofiilien suhteen. Nämä tutkimukset perustuvat Mtb-inkuboituihin supernatantteihin ja solupelletteihin, joissa käytetään Luminex-tekniikoita Mtb-spesifisten sytokiinien analysointiin. RNA-ilmentymismallit analysoidaan käyttämällä sekvensointia valituilta osallistujilta (naiset, joilla on TBI, naiset, joilla on tuberkuloositauti ja QFT-negatiiviset naiset), mitä seuraa qPCR, joka kohdistuu eri tavalla ilmentyneisiin geeneihin suuremmasta määrästä naisia, joilla on TB-infektio/sairaus ja QFT-negatiiviset naiset. (jotta voidaan tunnistaa naiset, joilla on erityyppisiä tuberkuloosiinfektioita, alkavia ja subkliinisiä sairauksia). Istukan löydöksiä verrataan näiden ryhmien välillä mukauttamalla muita tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa istukan toimintaan ja kehitykseen.

7. TB-spesifisten vasta-aineiden analysointi lymfosyyttisupernatanteissa raskaana olevilla naisilla, joilla on TBI, mykobakteeriaktiivisuuden ja tuberkuloosin vaiheen karakterisoimiseksi Tätä tarkoitusta varten BCG-spesifisiä vasta-aineita analysoidaan TBI-potilaiden naisten viljeltyjen PBMC-solujen supernatanteissa. PBMC:t eristetään käyttämällä solujen valmistusputkia ja viljelemällä mukautetuissa elatusaineissa. Viljelmän supernatanteista analysoidaan BCG-spesifisten vasta-aineiden esiintyminen, ja näitä malleja verrataan osallistujien välillä naisten alaryhmien erottamiseksi aktiivisen tai alkavan tuberkuloosin suhteen (vertaamalla malleja naisilla, joilla on kliininen tuberkuloosisairaus ja QFT-negatiiviset kontrollit) .