Efeitos da infecção tuberculosa no desenvolvimento e função da placenta

Fundo:

A tuberculose (TB) é uma causa importante de morbilidade e mortalidade materna a nível mundial, com o fardo mais elevado nos países de baixo rendimento. A gravidez tem sido associada ao aumento da incidência da doença tuberculosa em estudos baseados em registos realizados na Europa, sugerindo que a gravidez pode promover a progressão da infecção por TB (TBI). Numa coorte de mulheres grávidas que vivem em Adama, uma importante cidade da Etiópia, um terço das participantes teve TCE. No entanto, a incidência de TB durante a gravidez e o acompanhamento pós-parto nesta coorte foi relativamente baixa (8 casos entre 2.000 participantes durante 4 anos de acompanhamento). Curiosamente, os níveis de citocinas pró-inflamatórias desencadeadas pelo Mtb foram elevados durante as fases posteriores da gravidez, sugerindo aumento da atividade bacteriana durante a gravidez em mulheres com TCE. Além disso, marcadores inespecíficos de inflamação sistêmica em gestantes com TCE foram maiores em comparação com gestantes sem TCE. É provável que ambos os fenómenos se devam à modificação imunitária do controlo da TB induzida pela gravidez.

As consequências destas alterações imunitárias na gravidez não foram extensivamente estudadas. Além do risco aumentado de progressão para a doença tuberculosa, é possível que o TCE em mulheres grávidas possa ter outros efeitos adversos para a saúde, em particular no que diz respeito ao resultado da gravidez. Num estudo recente baseado em registos de mulheres que vivem na Suécia e são originárias de países onde a TB é endémica, examinadas para TCE nos cuidados pré-natais, descobriu-se que o TCE está associado a vários tipos de resultados adversos na gravidez. Este achado sugere que o TCE pode afetar o desenvolvimento e a função da placenta e, assim, contribuir para complicações na gravidez. Vários mecanismos podem estar envolvidos nos efeitos adversos da infecção materna no resultado da gravidez, incluindo infecção directa do tecido fetal e/ou placentário, bem como efeitos indirectos mediados pela inflamação sistémica com impacto no desenvolvimento e função da placenta.

Este projeto é um estudo aprofundado sobre as associações entre TCE e TB e patologia placentária, com base numa coorte de mulheres com parto em hospitais públicos da Etiópia. O objetivo geral é investigar a patologia placentária e marcadores de disfunção placentária em mulheres com infecção por TB e doença tuberculosa, com correlação com respostas imunes de Mtb e marcadores de atividade micobacteriana e com características de distúrbios da gravidez.

Descrição do projeto Os participantes serão recrutados e matriculados em enfermarias de parto em dois hospitais públicos de referência em Adis Abeba, Etiópia. Os procedimentos do estudo serão realizados por enfermeiras pesquisadoras e equipe de pesquisa, bem como por pessoal regular treinado baseado nos respectivos locais de estudo. Os procedimentos de estudo serão realizados principalmente durante o dia durante a semana.

Os dados do estudo serão obtidos antes e depois do parto. As informações dos participantes do estudo serão coletadas por meio de questionários estruturados eletrônicos, incluindo questões sobre condição sociodemográfica, história médica e obstétrica (gestações atuais e anteriores), bem como outras variáveis ​​recomendadas pelo banco de dados Global Pregnancy Collaboration COLLECT. Serão registrados dados detalhados sobre o estado físico materno e infantil (peso, altura, circunferência do braço, índice de Apgar), bem como detalhes do parto. Os dados do estudo serão inseridos e carregados usando tablets conectados a um servidor REDCAP. Amostras de sangue para fins de pesquisa serão obtidas na enfermaria de parto antes do parto. Antes da alta hospitalar, as mulheres serão novamente contatadas pela equipe do estudo para obter mais informações sobre o estudo. Neste momento, os participantes também receberão uma data agendada para a visita de acompanhamento de 6 semanas, bem como detalhes de contato da equipe do estudo.

As mulheres com sintomas ou sinais sugestivos de TB serão solicitadas a enviar duas amostras matinais de escarro para investigações bacteriológicas de TB. Outras investigações serão realizadas em mulheres com suspeita de TB extrapulmonar (dependendo do tipo de apresentação; por exemplo, aspiração com agulha fina em caso de linfadenopatia periférica).

Toda a placenta será cuidada dentro de 30 minutos após o parto pela equipe de patologia do estudo. Primeiro, a placenta será caracterizada física e macroscopicamente seguindo um protocolo de estudo baseado nas recomendações do Amsterdam Placental Workshop Group. A placenta será então armazenada em formalina, com posterior inclusão das partes selecionadas em parafina para investigações histopatológicas. Além disso (de mulheres com gravidez sem trabalho de parto que dão à luz no local do estudo TASH), porções de tecido da placenta serão obtidas para análise de expressão de RNA e proteína, bem como para microscopia eletrônica. Essas porções serão congeladas em gelo seco, com posterior transferência para -80° C. Logo após o parto, o sangue do cordão umbilical será coletado em tubos de EDTA (2-4 ml) para estudos posteriores sobre o perfil transcriptômico do RNA.

O sangue venoso será coletado em tubos de heparina de lítio (6 ml) para posterior teste QuantiFERON TB-Plus (QFT). Além disso, o sangue será coletado em tubos de EDTA (para análises de anticorpos; 4-6 ml).

A análise QFT para categorização do status do TCE será realizada dentro de uma semana após o parto. O resultado será comunicado aos participantes na visita de acompanhamento de 6 semanas. Para detectar TB subclínica, as mulheres com TCE serão encaminhadas para radiografia de tórax (independentemente dos sintomas) em conexão com esta consulta. Eles também serão solicitados a enviar duas amostras matinais de escarro para análises bacteriológicas de TB, conforme descrito acima.

Serão coletados os resultados dos exames de rotina obtidos na admissão na enfermaria de parto (HIV, malária, sífilis, diabetes, função renal, função hepática, hemograma).

Métodos laboratoriais

Sangue incubado com antígeno Mtb:

O sangue será coletado em tubos de heparina de lítio e separado em tubos QFT para incubação. Após a incubação, o sangue será centrifugado para separar o sobrenadante do sedimento celular. O QFT ELISA será realizado de acordo com a recomendação do fabricante. Os sobrenadantes restantes serão armazenados em alíquotas e os pellets celulares serão separados e armazenados após adição do estabilizador de RNA. O pellet de células incubadas com Mtb será usado para análise baseada em sequência da expressão de RNA de mulheres selecionadas com TCE e doença de TB para analisar padrões de atividade micobacteriana por comparação de padrões em mulheres com infecção por TB e aquelas com doença de TB (incluindo controles negativos para QFT ). Os sobrenadantes incubados com Mtb serão analisados ​​quanto a citocinas ligadas à atividade da TB (com base em dados de estudos anteriores sobre a dinâmica imunológica da TB durante a gravidez), utilizando plataformas tecnológicas Luminex.

Sangue não incubado:

O sangue venoso será obtido em tubos de EDTA para análise de anticorpos específicos para Mtb.

Placenta:

Porções de tecido placentário serão obtidas de diferentes partes de partes macroscopicamente normais da placenta. As porções serão obtidas tanto para estudos histopatológicos (formalina) quanto para outros estudos (para armazenamento em freezer). Todas as porções serão etiquetadas com códigos individuais.

Métodos para objetivos específicos de estudo:

1. Comparar a histopatologia placentária em mulheres com e sem infecção/doença por TB.

   Para tanto, cortes de placenta embebidos em parafina serão analisados ​​​​para diferentes tipos de alterações patológicas. Além disso, a microscopia eletrônica será realizada a partir de um subconjunto de participantes. Os examinadores não terão conhecimento do status do TBI e de outras características dos participantes. As alterações histopatológicas serão pontuadas. Posteriormente, será realizada comparação em relação ao status do TCE para determinar se a ocorrência de alterações patológicas difere entre essas categorias, com ajuste para condições concomitantes relevantes.

2. Comparar os padrões de expressão de RNA no tecido da placenta em mulheres com e sem infecção/doença por TB e correlacionar esses achados com padrões associados a distúrbios da gravidez e disfunção placentária.

   Para tanto, serão analisados ​​padrões de expressão de RNA em tecido placentário de mulheres com e sem infecção/doença TB, bem como de mulheres com e sem complicações pré-definidas na gravidez (pré-eclâmpsia, restrição de crescimento intra-uterino). Os participantes para este objetivo de estudo serão selecionados da coorte total, com base no status de infecção/doença por TB. Para evitar efeitos do trabalho de parto, apenas participantes com CE eletiva serão incluídos para esta análise (placenta não trabalhada).

   O sequenciamento em massa será usado para análise da transcriptômica do RNA. Padrões de genes diferencialmente expressos serão determinados nessas categorias, com análise bioinformática sobre como genes diferencialmente expressos de mulheres com infecção/doença de TB se correlacionam com aqueles em mulheres com distúrbios na gravidez (da população do estudo e da literatura). Esses padrões também serão comparados aos resultados individuais da gravidez (resultados adversos, desvios de peso ao nascer).

3. Analisar a expressão proteica no tecido placentário em gestantes com e sem TCE e correlacionar esses padrões com a patologia placentária.

   Para este objetivo, os padrões de expressão proteica em porções de tecido placentário não trabalhado serão caracterizados em relação ao estado de infecção/doença por TB. A análise será feita por espectrometria de massa. Os padrões de expressão proteica encontrados serão posteriormente correlacionados à patologia placentária e às características do resultado da gravidez.

4. Determinar a presença de Mtb no tecido placentário em mulheres com TCE. Para este fim, serão incluídos participantes com infecção/doença TB (juntamente com uma série de controles com resultados QFT negativos). Porções de tecido placentário serão investigadas com métodos para determinar a presença de Mtb, incluindo técnicas de histoquímica imunológica/hibridização in-situ e sondas específicas de Mtb que foram desenvolvidas para uso em amostras de tecido parafinizado.

5. Comparar fenótipos de células imunes no tecido placentário em mulheres grávidas com e sem infecção/doença por TB e correlacionar esses padrões com a patologia placentária.

   Para este objetivo, tecido placentário embebido em parafina será usado para identificar fenótipos de células imunes em mulheres em relação ao status de TCE. Métodos imunohistoquímicos serão realizados para esse fim.

6. Analisar a secreção de citocinas específicas do Mtb e os padrões de expressão de RNA no sangue estimulado pelo antígeno Mtb em mulheres com infecção/doença de TB para delinear grupos de mulheres com diferentes tipos de atividade de TB durante a gravidez e correlacionar esses padrões com achados placentários.

   Para tanto, as mulheres com TCE serão caracterizadas quanto aos perfis imunológicos que refletem a atividade da TB. Essas investigações serão baseadas em sobrenadantes e pellets celulares incubados com Mtb, utilizando técnicas Luminex para análise de citocinas específicas para Mtb. Os padrões de expressão de RNA serão analisados ​​usando sequenciamento de participantes selecionados (mulheres com TCE, mulheres com doença de TB e mulheres QFT-negativas), seguido por qPCR visando genes diferencialmente expressos de um número maior de mulheres com infecção/doença por TB e mulheres QFT-negativas (para identificar mulheres com diferentes tipos de infecção por TB, doença incipiente e subclínica). Os achados placentários serão comparados entre esses grupos, com ajuste para outros fatores que podem afetar a função e o desenvolvimento da placenta.

7. Analisar anticorpos específicos para TB em sobrenadantes de linfócitos em mulheres grávidas com TCE para caracterizar a atividade micobacteriana e o estágio da doença da TB. Para este objetivo, os anticorpos específicos para BCG serão analisados ​​em sobrenadantes de PBMCs cultivadas de mulheres com TCE. As PBMCs serão isoladas em tubos de preparo celular, com cultura em meio adaptado. Os sobrenadantes da cultura serão analisados ​​quanto à presença de anticorpos específicos para BCG, e esses padrões serão comparados entre os participantes para distinguir subconjuntos de mulheres em relação à TB ativa ou incipiente (com comparação de padrões em mulheres com doença clínica de TB e controles negativos para QFT) .