Effecten van tuberculose-infectie op de ontwikkeling en functie van de placenta

Achtergrond:

Tuberculose (tbc) is wereldwijd een belangrijke oorzaak van moedersterfte en -sterfte, met de hoogste ziektelast in lage-inkomenslanden. Zwangerschap is in verband gebracht met een verhoogde incidentie van tuberculose in registergebaseerde onderzoeken uit Europa, wat erop wijst dat zwangerschap de progressie van tuberculose-infectie (TBI) kan bevorderen. In een cohort zwangere vrouwen die in Adama, een grote Ethiopische stad, woonden, had een derde van de deelnemers traumatisch hersenletsel. Toch was de incidentie van tuberculose tijdens de zwangerschap en post-partum follow-up in dit cohort relatief laag (8 gevallen onder 2000 deelnemers gedurende 4 jaar follow-up). Interessant genoeg waren de niveaus van door Mtb geactiveerde pro-inflammatoire cytokines verhoogd tijdens latere stadia van de zwangerschap, wat duidt op verhoogde bacteriële activiteit tijdens de zwangerschap bij vrouwen met TBI. Bovendien waren niet-specifieke systemische ontstekingsmarkers bij zwangere vrouwen met traumatisch hersenletsel hoger vergeleken met zwangere vrouwen zonder traumatisch hersenletsel. Het is waarschijnlijk dat deze beide verschijnselen te wijten zijn aan door zwangerschap geïnduceerde immuunmodificatie van de tuberculosebestrijding.

De gevolgen van deze immuunveranderingen tijdens de zwangerschap zijn niet uitgebreid onderzocht. Afgezien van een verhoogd risico op progressie naar de ziekte tuberculose, is het mogelijk dat traumatisch hersenletsel bij zwangere vrouwen ook andere nadelige gevolgen voor de gezondheid kan hebben, vooral met betrekking tot de zwangerschapsuitkomst. In een recent, op registers gebaseerd onderzoek onder vrouwen in Zweden, afkomstig uit landen waar tuberculose voorkomt en die in de prenatale zorg op TBI zijn gescreend, bleek TBI geassocieerd te zijn met verschillende soorten ongunstige zwangerschapsresultaten. Deze bevinding suggereert dat TBI de ontwikkeling en functie van de placenta zou kunnen beïnvloeden en dus zou kunnen bijdragen aan zwangerschapscomplicaties. Er kunnen verschillende mechanismen betrokken zijn bij de nadelige effecten van maternale infectie op de zwangerschapsuitkomst, waaronder directe infectie van foetaal en/of placentaweefsel, evenals indirecte effecten gemedieerd door systemische ontsteking met impact op de ontwikkeling en functie van de placenta.

Dit project is een diepgaand onderzoek naar de associaties tussen TBI en tuberculose en placentale pathologie, gebaseerd op een cohort vrouwen met een bevalling in Ethiopische openbare ziekenhuizen. Het algemene doel is het onderzoeken van de pathologie van de placenta en markers van placentadysfunctie bij vrouwen met tuberculose-infectie en tuberculoseziekte, met correlatie met Mtb-immuunreacties en markers van mycobacteriële activiteit en met kenmerken van zwangerschapsstoornissen.

Projectbeschrijving Deelnemers zullen worden gerekruteerd en ingeschreven op de arbeidsafdelingen van twee openbare ziekenhuizen in Addis Abeba, Ethiopië. De onderzoeksprocedures zullen worden uitgevoerd door onderzoeksverpleegkundigen en onderzoekspersoneel, evenals door getraind regulier personeel op de respectieve onderzoekslocaties. Studieprocedures zullen op weekdagen voornamelijk overdag plaatsvinden.

Studiegegevens worden zowel voor als na de bevalling verkregen. Informatie van deelnemers aan de studie zal worden verzameld met behulp van elektronisch gestructureerde vragenlijsten, waaronder vragen over de sociaal-demografische toestand, de medische en verloskundige geschiedenis (huidige en eerdere zwangerschappen), evenals andere variabelen die worden aanbevolen door de Global Pregnancy Collaboration COLLECT-database. Gedetailleerde gegevens over de fysieke status van moeder en kind (gewicht, lengte, omtrek van de middenbovenarm, Apgar-score), evenals details over de bevalling, worden geregistreerd. Studiegegevens worden ingevoerd en geüpload met behulp van tablets die zijn verbonden met een REDCAP-server. Bloedmonsters voor onderzoeksdoeleinden worden vóór de bevalling op de verloskamer afgenomen. Vóór ontslag uit het ziekenhuis zullen de vrouwen opnieuw door het onderzoekspersoneel worden gecontacteerd voor meer informatie over het onderzoek. Op dit moment ontvangen de deelnemers ook een geplande datum voor het vervolgbezoek van zes weken, evenals contactgegevens van het onderzoeksteam.

Vrouwen met symptomen of tekenen die wijzen op tuberculose zullen worden gevraagd om twee ochtendsputummonsters in te dienen voor bacteriologisch tuberculoseonderzoek. Andere onderzoeken zullen worden uitgevoerd bij vrouwen met verdenking op extrapulmonale tuberculose (afhankelijk van het type ziekte; bijvoorbeeld fijne naaldaspiratie in geval van perifere lymfadenopathie).

De gehele placenta wordt binnen 30 minuten na de bevalling verzorgd door het studiepathologiepersoneel. Eerst zal de placenta fysiek en macroscopisch worden gekarakteriseerd volgens een onderzoeksprotocol gebaseerd op de aanbevelingen van de Amsterdam Placental Workshop Group. De placenta wordt vervolgens opgeslagen in formaline, waarna geselecteerde delen in paraffine worden ingebed voor histopathologisch onderzoek. Daarnaast zullen (van vrouwen met een onbewerkte zwangerschap die op de TASH-studielocatie bevallen) delen van placentaweefsel worden verkregen voor RNA- en eiwitexpressieanalyses, evenals voor elektronenmicroscopie. Deze porties worden ingevroren op droogijs, waarna ze worden overgebracht naar -80°C. Direct na de bevalling wordt navelstrengbloed verzameld in EDTA-buisjes (2-4 ml) voor vervolgonderzoek naar het RNA-transcriptieprofiel.

Veneus bloed wordt verzameld in lithiumheparinebuisjes (6 ml) voor daaropvolgende QuantiFERON TB-Plus (QFT)-tests. Daarnaast wordt er bloed afgenomen in EDTA-buisjes (voor antilichaamanalyse; 4-6 ml).

QFT-analyse voor categorisering van de TBI-status wordt binnen een week na de bevalling uitgevoerd. Het resultaat wordt aan de deelnemers meegedeeld tijdens het vervolgbezoek na 6 weken. Om subklinische tuberculose op te sporen, zullen vrouwen met TBI in verband met dit bezoek worden doorverwezen voor een röntgenfoto van de thorax (ongeacht de symptomen). Ook wordt hen gevraagd om twee ochtendsputummonsters in te leveren voor bacteriologische tbc-analyses zoals hierboven beschreven.

Resultaten van routinetesten verkregen bij opname op de arbeidsafdeling zullen worden verzameld (HIV, malaria, syfilis, diabetes, nierfunctie, leverfunctie, bloedbeeld).

Laboratoriummethoden

Met Mtb-antigeen geïncubeerd bloed:

Bloed wordt verzameld in lithiumheparinebuisjes en gescheiden in QFT-buisjes voor incubatie. Na de incubatie wordt het bloed gecentrifugeerd om het supernatant van de celpellet te scheiden. QFT ELISA wordt uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. De resterende supernatanten zullen in aliquots worden bewaard, en celpellets zullen worden gescheiden en bewaard na toevoeging van RNA-stabilisator. De met Mtb geïncubeerde celpellet zal worden gebruikt voor sequentiegebaseerde analyse van RNA-expressie van geselecteerde vrouwen met TBI en tuberculose om mycobacteriële activiteitspatronen te analyseren door patronen bij vrouwen met tuberculose-infectie te vergelijken met vrouwen met tuberculose (inclusief QFT-negatieve controles). ). Met Mtb geïncubeerde supernatanten zullen worden geanalyseerd op cytokines die verband houden met tuberculose-activiteit (gebaseerd op gegevens uit eerdere onderzoeken naar de immuundynamiek van tuberculose tijdens de zwangerschap), met behulp van Luminex-technologieplatforms.

Niet-geïncubeerd bloed:

Veneus bloed zal worden verkregen in EDTA-buisjes voor analyse van Mtb-specifieke antilichamen.

Placenta:

Delen van placentaweefsel zullen worden verkregen uit verschillende delen van macroscopisch normale delen van de placenta. Porties zullen worden verkregen voor zowel histopathologisch (formaline) als ander onderzoek (voor vriesopslag). Alle porties worden gelabeld met individuele codes.

Methoden voor specifieke studiedoelen:

1. Om de histopathologie van de placenta te vergelijken bij vrouwen met en zonder tuberculose-infectie/ziekte.

   Voor dit doel zullen secties van in paraffine ingebedde placenta worden geanalyseerd op verschillende soorten pathologische veranderingen. Daarnaast zal elektronenmicroscopie worden uitgevoerd bij een subgroep van deelnemers. Examinatoren zullen blind zijn voor de TBI-status en andere kenmerken van de deelnemers. De histopathologische veranderingen zullen worden gescoord. Vervolgens zal een vergelijking met betrekking tot de TBI-status worden uitgevoerd om te bepalen of het optreden van pathologische veranderingen verschilt tussen deze categorieën, met aanpassing voor relevante bijkomende aandoeningen.

2. Om RNA-expressiepatronen in placentaweefsel te vergelijken bij vrouwen met en zonder tuberculose-infectie/ziekte, en om deze bevindingen te correleren met patronen geassocieerd met zwangerschapsstoornissen en placenta-disfunctie.

   Voor dit doel zullen RNA-expressiepatronen worden geanalyseerd in placentaweefsel van vrouwen met en zonder tuberculose-infectie/ziekte, evenals van vrouwen met en zonder vooraf gedefinieerde zwangerschapscomplicaties (pre-eclampsie, intra-uteriene groeivertraging). Deelnemers voor dit onderzoeksdoel zullen worden geselecteerd uit het totale cohort, op basis van de tuberculose-infectie/ziektestatus. Om effecten van de bevalling te voorkomen, worden alleen deelnemers met keuzevak CS in deze analyse opgenomen (onbewerkte placenta).

   Bulksequencing zal worden gebruikt voor de analyse van RNA-transcripties. Patronen van differentieel tot expressie gebrachte genen zullen in deze categorieën worden bepaald, met bioinformatische analyse van hoe differentieel tot expressie gebrachte genen van vrouwen met tuberculose-infectie/ziekte correleren met die van vrouwen met zwangerschapsstoornissen (uit de onderzoekspopulatie en uit de literatuur). Deze patronen zullen ook worden vergeleken met individuele zwangerschapsuitkomsten (ongunstige uitkomst, afwijkingen in geboortegewicht).

3. Om de eiwitexpressie in placentaweefsel te analyseren bij zwangere vrouwen met en zonder TBI, en om deze patronen te correleren met placentale pathologie.

   Voor dit doel zullen eiwitexpressiepatronen in delen van onbewerkt placentaweefsel worden gekarakteriseerd met betrekking tot de tuberculose-infectie/ziektestatus. De analyse zal gebeuren met behulp van massaspectrometrie. De gevonden eiwitexpressiepatronen zullen vervolgens gecorreleerd worden met de pathologie van de placenta en met kenmerken van de zwangerschapsuitkomst.

4. Om de aanwezigheid van Mtb in placentaweefsel te bepalen bij vrouwen met TBI. Voor dit doel zullen deelnemers met een tuberculose-infectie/ziekte worden geïncludeerd (samen met een aantal controles met negatieve QFT-resultaten). Delen van placentaweefsel zullen worden onderzocht met methoden om de aanwezigheid van Mtb te bepalen, waaronder immuunhistochemie/in-situ hybridisatietechnieken, en Mtb-specifieke probes die zijn ontwikkeld voor gebruik in geparaffineerde weefselmonsters.

5. Het vergelijken van immuuncelfenotypes in placentaweefsel bij zwangere vrouwen met en zonder tuberculose-infectie/ziekte, en deze patronen correleren met placentale pathologie.

   Voor dit doel zal in paraffine ingebed placentaweefsel worden gebruikt om immuuncelfenotypes bij vrouwen te identificeren met betrekking tot de TBI-status. Hiervoor zullen immunohistochemische methoden worden uitgevoerd.

6. Het analyseren van Mtb-specifieke cytokinesecretie- en RNA-expressiepatronen in door Mtb-antigeen gestimuleerd bloed bij vrouwen met tuberculose-infectie/ziekte om groepen vrouwen met verschillende soorten tuberculose-activiteit tijdens de zwangerschap af te bakenen, en om deze patronen te correleren met bevindingen uit de placenta.

   Voor dit doel zullen vrouwen met TBI worden gekarakteriseerd met betrekking tot immuunprofielen die de tuberculose-activiteit weerspiegelen. Deze onderzoeken zullen gebaseerd zijn op met Mtb geïncubeerde supernatanten en celpellets, waarbij gebruik wordt gemaakt van Luminex-technieken voor de analyse van Mtb-specifieke cytokines. RNA-expressiepatronen zullen worden geanalyseerd met behulp van sequencing van geselecteerde deelnemers (vrouwen met TBI, vrouwen met tuberculose en QFT-negatieve vrouwen), gevolgd door qPCR die zich richt op differentieel tot expressie gebrachte genen van een groter aantal vrouwen met tuberculose-infectie/ziekte en QFT-negatieve vrouwen (om vrouwen met verschillende soorten tuberculose-infecties, beginnende en subklinische ziekten te identificeren). De bevindingen over de placenta zullen tussen deze groepen worden vergeleken, met aanpassing voor andere factoren die de functie en ontwikkeling van de placenta kunnen beïnvloeden.

7. Om tbc-specifieke antilichamen in supernatanten van lymfocyten bij zwangere vrouwen met TBI te analyseren om de mycobacteriële activiteit en het ziektestadium van tbc te karakteriseren. Voor dit doel zullen BCG-specifieke antilichamen worden geanalyseerd in supernatanten van gekweekte PBMC's van vrouwen met TBI. PBMC's zullen worden geïsoleerd met behulp van celpreparatiebuizen, met kweek op aangepaste media. Cultuursupernatanten zullen worden geanalyseerd op de aanwezigheid van BCG-specifieke antilichamen, en deze patronen zullen tussen deelnemers worden vergeleken om subgroepen van vrouwen te onderscheiden met betrekking tot actieve of beginnende tuberculose (met vergelijking van patronen bij vrouwen met klinische tuberculose en QFT-negatieve controles). .