商用段階の保存バッファーの有効性を調査し、腸内メタプロテオームの個人間のばらつきを評価する (PROTEGI)

A. はじめに:

メタプロテオミクスは、微生物群集のタンパク質補体全体を研究し、腸内マイクロバイオームのような複雑な生態系についての洞察を提供します。 メタプロテオミクスにより、研究者は腸内マイクロバイオームを深く調査し、これらの微生物の存在量と機能的活動についての洞察を得ることができます。 この知識は、炎症性腸疾患（Zhang et al., 2018）や肥満（Biemann et al., 2021）など、さまざまな疾患の根底にあるメカニズムを解明するのに役立ちました。 研究者は、主要なタンパク質の特徴を特定することで、基礎となる生物学に基づいて個別化医療と精密医療のための的を絞った戦略を開発できます (Nice, 2022)。

腸内マイクロバイオーム研究では、微生物群集とそのプロテオームの完全性を維持するために、標準化されたサンプル収集と保存が特に重要です。 実際、信頼できる結果を得るには、温度や酸素量などの環境の影響に対する感受性を考慮する必要があります。 腸内マイクロバイオームのメタプロテオミクス研究では、破壊や汚染を最小限に抑え、天然の微生物組成とタンパク質プロファイルを保存するために、非侵襲的または低侵襲的方法が好まれます。 また、サンプルの取り扱いと保管方法は、タンパク質の分解と微生物集団の安定性に影響を与えます。 このため、分析までサンプルの完全性を維持するために、即時凍結または低温 (-80°C など) での保存が推奨されることがよくあります (Hickl et al., 2019)。 ただし、保管と輸送にコールド チェーンを使用することは、大規模で非局所的な研究に必要な現場でのサンプリング戦略と両立しません。 さらに、これは、潜在的な室温オプションよりも理想的ではなく、より高価で、物流的に面倒です。

さらに、糞便サンプルの収集/保存方法に関する現在の知識は、分析のために研究室に輸送される間の核酸または代謝産物の保存に基づいています。 しかし、タンパク質の保存には異なる戦略が必要であり、研究はほとんどなく、核酸または代謝産物の分析の場合に使用される装置または試薬の採用に依存しています（Mordant & Kleiner、2021）。 したがって、メタプロテオミクス研究全体での再現性と比較可能性を確保するには、メタデータ収集と合わせて調整および標準化されたプロトコルが不可欠です。

本研究は、ヒトの腸糞便サンプルの長期保存に対するいくつかの市販の無害な緩衝液の適合性を評価することを目的としています。 糞便サンプルは 5 つの異なるバッファーに保存され、直接凍結されたサンプルでベンチマークが行われます。 メタプロテオミクスを使用して、プロテオミクス、分類学的、機能的同定を比較し、ヒト糞便の信頼できる保存ソリューションとしてのこれらのバッファーの可能性を理解します。 この研究はユニークであり、私たちの知る限り、この難しい質問に取り組んだ同様の研究はありません。

ヒトにおける予備的な証拠は、宿主およびマイクロバイオームのプロテオームの個体間および個体内の変動性を示しています（Mehta et al., 2018）。 特に、腸内マイクロバイオームにおける個人内の分類学的および機能的な変動は、時間の経過に伴う個人間の変動よりも小さいと思われます。 ただし、メタトランスクリプトミクス プロファイルは、被験者内および被験者間で同等のばらつきを示しました。 したがって、メタプロテオミクスを使用して、参加者から定期的に収集された糞便サンプルを研究することにより、プロテオームレベルで個体間および個体内の変動を評価することを目的としています。

B. 学術的および社会的関連性:

研究の最初の部分は、採取場所から処理場所までのサンプル輸送中にタンパク質の完全性を維持するための最も効果的な保存緩衝液を定義することを目的としています。これは、健康と疾患に適用されるメタプロテオミクスの将来における重要な要素です。 その重要性にもかかわらず、同様の評価はプロテオミクス応用に対しては行われていません。 この知識は、大規模なヒト糞便プロテオミクス研究に使用される学術目的にとって非常に重要です。 人々がメタプロテオミクスを通じて腸の健康状態を検査し、微生物群集に基づいた個別化医療や治療介入の可能性を引き出すには、一貫したサンプル収集が必要であり、この研究はそれを提供します。

研究の第 2 部は、腸内マイクロバイオームの組成と機能に観察される変動性をプロテオミクスの観点から理解することを目的としています。 腸内マイクロバイオームは動的であり、食事（Kolmeder et al.、2016）、年齢（Ghosh et al.、2022）、遺伝学（Kurilshikov et al.、2021）、環境（Nurkolis et al.、2021）などの複数の要因によって変化することが知られています。 al.、2022）など。 これらの変動は、個人間と個人内に大別できます。 個人間の変動とは、集団または集団内の個人間に観察される差異を指し、遺伝子構成、生理学的パラメーター、ライフスタイル要因、環境への曝露など、幅広い特性が含まれます。 同じ「コミュニティ」に属する人々の個人間のばらつきを理解することは、個別化医療などの分野では不可欠であり、個別化された介入によって個人差を考慮して治療結果を最適化することができます。 一方、個体内変動は、同じ個人内で経時的または異なる条件下で観察される変動を指し、概日リズム、ホルモン変動、または刺激に対する生理学的反応などの生物学的変動から生じる可能性があります。 個人内変動の認識と特徴付けは、研究結果を正確に解釈し、生物学的測定の信頼性を評価するために、特に縦断的研究や臨床モニタリングのシナリオにおいて非常に重要です。 この研究は、参加者の糞便サンプルから収集されたプロテオミクスデータを通じてこれらの変動を理解し、腸内マイクロバイオームで検出される変動を定義することを目的としています。

C. 目的:

1. 収集されたヒト糞便物質の保存と輸送に使用される 5 つの異なる緩衝液の影響をメタプロテオミクス プロファイルによって特定する。
2. 微生物叢と宿主プロテオームの変動性を個体間および個体内レベルで判断する。

D. 研究デザイン:

第一段階では、現場での糞便サンプリングと輸送保存のために以下のプロトコルを展開します: 参加者 (研究室/部門のメンバーから募集) には 18 本のチューブ (番号 1 ～ 18、15 ml 円錐形遠心分離機) が提供されます。チューブ、Ref# 339650、Thermo Scientific、および 18 個の使いやすい市販のスワブ (C1052-50、Zymo Research) またはスパチュラ (DNAGenotek)。 18 本のチューブは、6 つの異なる実験条件の 3 つの保存時点に対応します: 対照サンプルとしての空のチューブ (保存液なし) と 5 つの異なる非危険性糞便保存液: (a) SDS を含む社内バッファー (LB と呼ばれます) (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100、Zymo Research)、(c) Copan Amies バッファー (480CE、Copan Italia SpA)、(d) OMNIgene・GUT (OM200、DNAGenotek)、(e) OMNImet・GUT（ME200、DNAGenotek）。 簡単に説明すると、LB、Zymo Shield、OM200 には生体分子の保存に役立つ界面活性剤が含まれていることが知られており、Copan Amies バッファーは細胞の生存を維持することが知られ、培養学での応用が示されている無栄養培地であり、ME200 は溶媒ベースで有用です。メタボロミクスの応用で。 さらに、参加者には、便のサンプリングを容易にするためにトイレの上に展示される市販の便キャッチャー (Servoprax Stuhlfaenger、www.medundorg.de の参照番号 H7 61000-50) と、3 つのコントロールが入ったアイスパックの入った小さな箱が与えられます。サンプルは保管され、研究室に輸送されます。 これらの氷に保存されたコントロール サンプルは、さまざまな保存バッファーのパフォーマンスを評価するための鍵となります。 参加者は24時間以内にサンプルを私たちの研究室に持ち込みます。 対照サンプルは、研究室で受け取られたら、確立されたプロトコールを使用してさらなる生化学的処理が行われるまで、-80°C で保存されます (Gómez-Varela et al., 2023)。 残りのサンプルは、オービタルシェーカーインキュベーター内で +20°C で合計 2、5、および 10 日間保管されます (異なる保管/輸送時間をシミュレートします)。 これらの時点の終了後、確立されたプロトコルを使用してさらなる生化学的処理が行われるまで、サンプルは -80°C で保存されます (Gómez-Varela et al., 2023)。 メタプロテオミクス プロファイル (腸内マイクロバイオームと宿主生理学の分類学的および機能的変化を示します。Gomez-Varela, 2023 の場合のように、これらのサンプルから得られるもの) から、最適な保存液 (マイクロバイオームの組成と機能がより優れたものとして定義される) についての情報が得られます。コントロールサンプルと同様）。 この実験は研究の第 II 相を開始するために必要ですが、メタプロテオミクスにおける最適な社内糞便サンプリングの実践に関するガイドラインが確立されていないため、この分野では新規です。 6 人の健康な参加者 (薬学部薬理学・毒性学科の痛みのシステム生物学研究室のメンバーの中から) が募集されます。 これは参加者グループを持たないランダム化研究です。 サンプルは一度収集され、さまざまな条件を表す 18 個のチューブに分配されます。 最適な保存溶液を見つけるには、被験者 6 人のサンプル サイズで十分であり、サンプリングは参加者による正常な排便状態で 1 回実行されます。 さらに、参加者は、年齢、性別、体格指数、胃腸症状評価尺度（GSRS）、サンプル採取前の過去 30 日間の抗生物質の投与、ブリストル便フォームなどの情報を含むアンケート（添付）に記入します。スケール (BSFS)、および 18 個のチューブでのサンプル収集に必要なおおよその時間 (酸化プロセスによる潜在的な影響を考慮するため)。

第 2 段階では、参加者は定期的な排便中に 4 週間にわたって糞便サンプルを収集することが求められます (異なる最大 10 回)。 被験者には、最も優れた保存緩衝液（研究の第 1 段階で定義、上記を参照）を含む適切な数の 15 ml 円錐遠心管（339650、Thermo Scientific）と、便キャッチャーを備えた市販の収集装置が提供されます。 。 研究室で受け取られたサンプルは、確立されたプロトコールを使用してさらなる生化学的処理が行われるまで、-80°C で保管されます。 さらに、参加者はアンケートに記入します (上記を参照)。 参加者は、本研究に参加するすべてのリスクと利点についての説明を受け、ヘルシンキ宣言に従って書面によるインフォームドコンセントフォームに署名した後、自発的に実験に参加します（添付の同意フォームを参照）。 参加者は、便サンプルを収集し（上記を参照）、できるだけ早い機会にサンプルを薬理学毒物学科に提出するために必要なサンプリング装置を指導され、提供されます。 参加者は、上記のような情報を含む自己記入式のアンケートに回答することが求められます。 第 2 段階では、ドロップアウト率 20% の可能性を考慮して、健康な参加者 46 名 (研究室/部門のメンバーのうち) を男女 (男性 23 名、女性 23 名) から募集します。 これは参加者グループを持たないランダム化研究です。 サンプルサイズは、Kaczmarek et al., 2017 によって報告された経時的な Eggerthella 推定値の閾値に基づいて計算されました。 使用される統計手順は、F 検定です。Cohens'd = 0.75、1-β= 0.80、および α= 0.05 の値を使用して反復測定を行う二元配置分散分析です。 合計 400 ～ 460 のサンプルが収集される予定です。

E. 参考文献:

Biemann, R.、Buß, E.、Benndorf, D.、Lehmann, T.、Schallert, K.、Püttker, S.、Reichl, U.、Isermann, B.、Schneider, J. G.、Saake, G.、&ヘイアー、R. (2021)。 糞便メタプロテオミクスにより、生活習慣による体重減少後の腸の炎症の軽減と微生物の代謝の変化が明らかになりました。 生体分子、11(5)、第 5 条。 https://doi.org/10.3390/biom11050726 T.S. ゴーシュ、F. シャナハン、P.W. オトゥール (2022)。 健康的な老化のモジュレーターとしての腸内マイクロバイオーム。 Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology、19(9)、565-584。 https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D.、Xian, F.、Grundtner, S.、Sondermann, J. R.、および Schmidt, M. (2023)。 DIA-PASEF メタプロテオミクスによる宿主とマイクロバイオームの相互作用の分類学的および機能的特徴付けの増加。 微生物学のフロンティア、14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek、J.L.、Musaad、S.M.、および Holscher、H.D. (2017)。 一日の時間帯と食事行動は、ヒトの胃腸微生物叢の構成と機能に関連しています。 アメリカ臨床栄養学ジャーナル、106(5)、1220-1231。 https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O.、Heintz-Buschart, A.、Trautwein-Schult, A.、Hercog, R.、Bork, P.、Wilmes, P.、および Becher, D. (2019)。 サンプルの保存と保管は、ヒト腸内マイクロバイオームのメタプロテオミクス研究における分類学的および機能的プロファイルに大きな影響を与えます。 微生物、7(9)、第 9 条。 https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A.、Salojärvi, J.、Ritari, J.、de Been, M.、Raes, J.、Falony, G.、Vieira-Silva, S.、Kekkkonen, R. A.、Corthals, G. L.、Palva, A.、サロネン、A.、デ ヴォス、W.M. (2016)。 糞便メタプロテオミクス分析により、成人における個別化された安定した機能的マイクロバイオームとプロバイオティクス介入の限定的な効果が明らかになりました。 PloS One、11(4)、e0153294。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 クリルシコフ、A.、メディナ＝ゴメス、C.、バシガルペ、R.、ラジャブザデ、D.、ワン、J.、デミルカン、A.、ル・ロイ、C. I.、ライゴザ・ガライ、J. A.、フィニクム、C. T.、リュー、X. 、ゼルナコワ、D.V.、ボンダー、M.J.、ハンセン、T.H.、フロスト、F.、リューレマン、M.C.、ターピン、W.、ムーン、J.-Y.、キム、H.-N.、リュール、K.、… ゼルナコワ、A. (2021)。 大規模な関連解析により、ヒトの腸内マイクロバイオームの組成に影響を与える宿主因子が特定されます。 ネイチャージェネティクス、53(2)、156-165。 https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta、R.S.、Abu-Ali、G.S.、Drew、D.A.、Lloyd-Price、J.、Subramanian、A.、Lochhead、P.、Joshi、A.D.、Ivey、K.L.、Khalili、H.、Brown、G.T.、DuLong、 C.、ソング、M.、グエン、L.H.、マリック、H.、リム、E.B.、イザード、J.、ハッテンハワー、C.、チャン、A.T. (2018)。 成人男性のコホートにおけるヒト糞便マイクロバイオームの安定性。 ネイチャー微生物学、3(3)、347-355。 https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 モーダント、A.、クライナー、M. (2021)。 腸内マイクロバイオームのメタプロテオミクス分析のためのサンプルの保存および保管方法の評価。 微生物学スペクトル、9(3)、e0187721。 https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 E.C. ニース (2022)。 2020年代に入ったプロテオミクスの現状：個別化・精密医療に向けて。 分析生化学、644、113840。 https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F.、Mayul, N.、Yasmine, N.、Puspaningtyas, D.S.、および Taslim, NA (2022)。 人間の活動と腸内微生物叢の変化: 視点。 人間の栄養と代謝、30、200165。 https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X.、Deeke, S. A.、Ning, Z.、Starr, A.E.、Butcher, J.、Li, J.、Mainne, J.、Cheng, K.、Liao, B.、Li, L.、Singleton、 R.、マック、D.、スティンツィ、A.、フィゲイズ、D. (2018)。 メタプロテオミクスは、小児炎症性腸疾患におけるマイクロバイオームと腸細胞外小胞タンパク質との関連を明らかにします。 Nature Communications、9(1)、2873。 https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4