상업 단계 저장 버퍼의 효율성 조사 및 개인 간 장 메타프로테옴 가변성 평가 (PROTEGI)

A. 소개:

Metaproteomics는 미생물 군집의 전체 단백질 보완물을 연구하고 장내 미생물 군집과 같은 복잡한 생태계에 대한 통찰력을 제공합니다. 메타프로테오믹스(Metaproteomics)를 통해 연구자들은 장내 미생물 군집을 깊이 파고들어 이들 미생물의 풍부함과 기능적 활동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 지식은 염증성 장질환(Zhang et al., 2018) 및 비만(Biemann et al., 2021)과 같은 다양한 질병의 기저 메커니즘을 설명하는 데 중요한 역할을 했습니다. 연구자들은 주요 단백질 시그니처를 식별함으로써 기본 생물학(Nice, 2022)을 기반으로 맞춤형 의학 및 정밀 의료를 위한 표적 전략을 개발할 수 있습니다.

장내 미생물 연구에서 표준화된 샘플 수집 및 보존은 미생물 군집과 그 프로테옴의 무결성을 보존하는 데 특히 중요합니다. 실제로 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 온도 및 산소량과 같은 환경 영향에 대한 민감성을 고려해야 합니다. 장내 미생물군유전체 메타프로테오믹스 연구의 경우, 파괴나 오염을 최소화하고 고유 미생물 구성과 단백질 프로필을 보존하기 위해 비침습적 또는 최소 침습적 방법이 선호됩니다. 또한 시료 취급 및 보관 전략은 단백질 분해 및 미생물 집단 안정성에 영향을 미칩니다. 이러한 이유로 분석까지 샘플 무결성을 유지하기 위해 즉시 냉동하거나 저온(예: -80°C)에서 보존하는 것이 종종 권장됩니다(Hickl et al., 2019). 그러나 보관 및 운송을 위해 콜드 체인을 사용하는 것은 대규모 및 비국소화 연구에 필요한 현장 샘플링 전략과 호환되지 않습니다. 더욱이 이는 잠재적인 실온 옵션보다 덜 이상적이며 비용이 많이 들고 물류적으로 지루합니다.

더욱이, 분변 샘플 수집/보존 방법에 대한 현재 지식은 분석을 위해 실험실로 운반하는 동안 핵산이나 대사산물을 보존하는 데 기반을 두고 있습니다. 그러나 단백질 보존에는 다양한 전략이 필요하며 연구는 거의 없으며 핵산이나 대사산물 분석의 경우 사용되는 장치나 시약을 채택하는 데 의존합니다(Mordant & Kleiner, 2021). 따라서 메타프로테오믹 연구 전반에 걸쳐 재현성과 비교 가능성을 보장하려면 메타데이터 수집과 함께 맞춤화되고 표준화된 프로토콜이 필수적입니다.

본 연구는 시간이 지남에 따라 인간 내장 배설물 샘플을 저장하기 위한 여러 상업용 및 비유해 완충제의 적합성을 평가하는 것을 목표로 합니다. 대변 ​​샘플은 5개의 서로 다른 완충액에 저장되며 직접 냉동된 샘플을 사용하여 벤치마킹됩니다. 메타단백질체학을 사용하여 우리는 단백질체학, 분류학 및 기능적 식별을 비교하여 인간 배설물에 대한 신뢰할 수 있는 저장 솔루션으로서의 이러한 버퍼의 잠재력을 이해합니다. 이 연구는 독특하며 우리가 아는 한, 이 까다로운 질문을 다룬 유사한 연구는 없습니다.

인간에 대한 예비 증거는 숙주와 미생물군집의 프로테옴의 개체 간 및 개체 내 가변성을 보여주었습니다(Mehta et al., 2018). 특히 장내 미생물 군집의 개인 내 분류학적 및 기능적 변이는 시간이 지남에 따라 개인 간 변이보다 낮은 것으로 보입니다. 그러나, 메타전사체학 프로파일은 피험자 내에서 그리고 피험자 간에 비슷한 가변성을 나타냈습니다. 따라서 우리는 메타프로테오믹스를 사용하여 참가자로부터 주기적으로 수집된 대변 샘플을 연구함으로써 프로테옴 수준에서 개체 간 및 개체 내 변동성을 평가하는 것을 목표로 합니다.

B. 학문적, 사회적 관련성:

연구의 첫 번째 부분은 수집 현장에서 처리 현장으로 샘플을 운송하는 동안 단백질 무결성을 보존하기 위한 가장 효과적인 저장 완충액을 정의하는 것을 목표로 합니다. 이는 건강과 질병에 적용되는 메타프로테오믹스의 미래에 대한 핵심 요소입니다. 그 중요성에도 불구하고, 단백질체학 적용에 대해서는 유사한 평가가 수행되지 않았습니다. 이 지식은 대규모 인간 배설물 단백질체학 연구에 사용되는 학문적 목적에 매우 중요합니다. 사람들이 메타프로테오믹스를 통해 장 건강을 검사하고 미생물 군집 기반 맞춤 의학 및 치료 중재의 잠재력을 활용하려면 일관된 샘플 수집이 필요하며 본 연구에서는 이를 제공할 것입니다.

연구의 두 번째 부분은 프로테오믹스 관점에서 장내 미생물 구성과 기능에서 관찰할 수 있는 가변성을 이해하도록 설계되었습니다. 장내 미생물군집은 역동적이며 식단(Kolmeder et al., 2016), 연령(Ghosh et al., 2022), 유전학(Kurilshikov et al., 2021), 환경(Nurkolis et al.)과 같은 여러 요인에 의해 변경되는 것으로 알려져 있습니다. al., 2022) 등 이러한 변이는 크게 개인간 변이와 개인 내 변이로 분류될 수 있습니다. 개인간 변동성은 집단이나 그룹 내의 개인 간에 관찰되는 차이를 말하며, 유전적 구성, 생리학적 매개변수, 생활 방식 요인 및 환경 노출을 포함한 광범위한 특성을 포괄할 수 있습니다. 동일한 "공동체"에 속한 사람들의 개인 간 다양성을 이해하는 것은 맞춤형 의료와 같은 분야에서 필수적입니다. 여기서 맞춤형 개입은 개인차를 설명하여 치료 결과를 최적화합니다. 반면, 개인 내 변동성은 동일한 개인 내에서 시간이 지남에 따라 또는 다른 조건 하에서 관찰되는 변이를 의미하며 일주기 리듬, 호르몬 변동 또는 자극에 대한 생리적 반응과 같은 생물학적 변동에서 발생할 수 있습니다. 개인 내 변동성을 인식하고 특성화하는 것은 연구 결과를 정확하게 해석하고 특히 종단 연구 또는 임상 모니터링 시나리오에서 생물학적 측정의 신뢰성을 평가하는 데 중요합니다. 본 연구는 참가자의 대변 샘플에서 수집된 단백질체학 데이터를 통해 이러한 변동성을 이해하고 장내 미생물군집에서 검출된 변수를 정의하는 것을 목표로 합니다.

C. 목표:

1. 수집된 인간 배설물의 저장 및 운송에 사용되는 5가지 서로 다른 완충제의 효과를 메타단백질체 프로파일을 통해 확인합니다.
2. 개인 간 및 개인 내 수준에서 미생물군과 숙주 단백질체의 다양성을 확인합니다.

D. 연구 설계:

첫 번째 단계에서는 현장 배설물 샘플링 및 운송 보존을 위해 다음 프로토콜을 배포합니다. 참가자(실험실/부서 구성원으로 모집)에게는 튜브 18개(번호 1-18, 15ml 원추형 원심분리기)가 제공됩니다. 튜브; Ref# 339650, Thermo Scientific 및 18개의 사용하기 쉬운 상업용 면봉(C1052-50, Zymo Research) 또는 주걱(DNAGenotek). 18개 튜브는 6가지 다른 실험 조건의 3가지 저장 시점에 해당합니다. 대조 샘플인 빈 튜브(보존액 없음)와 5가지 다른 비유해 분변 보존액: (a) SDS가 포함된 내부 완충액(LB라고 함) 및 상업적으로 구입한 요소, (b) Zymo DNA/RNA Shield(R1100, Zymo Research), (c) Copan Amies 완충액(480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene·GUT(OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT(ME200, DNAGenotek). 간단히 말하면, LB, Zymo Shield 및 OM200은 생체분자를 보존하는 데 도움이 되는 세제를 포함하는 것으로 알려져 있으며, Copan Amies 완충액은 세포의 생존을 유지하는 것으로 알려진 무영양 배지이며 배양학에 응용할 수 있는 것으로 나타났습니다. ME200은 용매 기반의 유용한 배지입니다. 대사체 응용 분야에서. 또한, 참가자는 배설물 샘플링을 용이하게 하기 위해 변기 위에 전시되는 상업용 대변 수집기(Servoprax Stuhlfaenger, www.medundorg.de의 참조 번호 H7 61000-50)와 세 가지 컨트롤이 들어 있는 얼음 팩이 들어 있는 작은 상자를 받게 됩니다. 샘플은 보관되어 실험실로 운반됩니다. 얼음에 저장된 이러한 대조 샘플은 다양한 저장 버퍼의 성능을 평가하는 데 중요합니다. 참가자들은 다음 24시간 이내에 샘플을 우리 실험실로 가져올 것입니다. 실험실에 접수된 대조 샘플은 확립된 프로토콜을 사용하여 추가 생화학적 처리가 이루어질 때까지 -80°C에서 보관됩니다(Gómez-Varela et al., 2023). 나머지 샘플은 총 2일, 5일, 10일 동안 오비탈 셰이커 인큐베이터 내부 +20°C에서 보관됩니다(다양한 보관/운송 시간 시뮬레이션). 이 시점이 끝나면 샘플은 확립된 프로토콜을 사용하여 추가 생화학적 처리가 이루어질 때까지 -80°C에서 보관됩니다(Gómez-Varela et al., 2023). 메타프로테옴 프로필(장내 미생물군집과 숙주 생리학의 분류학적 및 기능적 변화를 나타냅니다. Gomez-Varela, 2023에서와 같이 이러한 샘플에서 나온)은 최상의 보존 액체(미생물군집 구성과 기능이 더 많은 액체로 정의됨)에 대해 알려줍니다. 대조 샘플과 같습니다). 이 실험은 연구의 2단계를 시작하는 데 필요하며, 메타프로테오믹스에서 최고의 사내 대변 샘플링 관행에 대한 지침이 확립되어 있지 않기 때문에 현장에서 새로운 것입니다. 6명의 건강한 참가자(통증 시스템 생물학 실험실, 약리학 및 독성학부, 약학부 구성원 중)를 모집합니다. 이는 참여자 그룹이 없는 무작위 연구입니다. 샘플은 한 번 수집되어 다양한 조건을 나타내는 18개의 튜브에 배포됩니다. 6명의 피험자의 표본 크기는 최상의 보존 솔루션을 찾기에 충분하며 샘플링은 참가자의 정상적인 배변 중에 1회 수행됩니다. 또한 참가자는 연령, 성별, 체질량 지수, 위장관 증상 등급 척도(GSRS), 검체 채취 전 지난 30일 동안의 항생제 투여, 브리스톨 대변 양식 등의 정보가 포함된 설문지(첨부)를 작성하게 됩니다. 규모(BSFS) 및 18개 튜브에서 샘플을 수집하는 데 필요한 대략적인 시간(산화 과정으로 인한 잠재적 영향을 설명하기 위해).

두 번째 단계에서 참가자는 정규 배변 중 4주 동안(최대 10회) 대변 샘플을 수집해야 합니다. 최고 성능의 보존 완충액(연구의 첫 번째 단계에서 정의됨, 위 참조)이 포함된 적절한 수의 15ml 원뿔형 원심분리 튜브(339650, Thermo Scientific)와 대변 수집 장치가 있는 상업용 수집 장치가 제공됩니다. . 실험실에 접수된 샘플은 확립된 프로토콜을 사용하여 추가 생화학적 처리가 이루어질 때까지 -80°C에 보관됩니다. 또한 참가자는 설문지를 작성합니다(위 참조). 참가자는 본 연구 참여에 따른 모든 위험과 이점에 대한 설명을 듣고 헬싱키 선언에 따른 서면 동의서(첨부된 동의서 참조)에 서명한 후 자발적으로 실험에 참여하게 됩니다. 참가자는 대변 샘플(위 참조)을 수집하고 가능한 한 빠른 시일 내에 약리학 및 독성학부에 샘플을 제출하는 데 필요한 샘플링 장치를 교육받고 제공됩니다. 참가자는 위에서 설명한 것과 같은 정보가 포함된 자가 작성 설문지를 작성해야 합니다. 두 번째 단계에서는 탈락률 20%를 고려하여 남녀 23명(남녀 23명) 중에서 건강한 참가자(본 연구실/부서 구성원 중) 46명을 모집합니다. 이는 참여자 그룹이 없는 무작위 연구입니다. 표본 크기는 Kaczmarek et al., 2017이 보고한 시간에 따른 Eggerthella 추정치의 임계값을 기반으로 계산되었습니다. 사용된 통계 절차는 F 테스트(Cohens'd = 0.75, 1-β= 0.80 및 α= 0.05) 값을 사용하여 반복 측정하는 양방향 ANOVA입니다. 총 400~460개의 샘플이 수집될 것으로 예상됩니다.

마. 참고문헌:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & 헤이어, R. (2021). 분변 메타프로테오믹스(Fecal Metaproteomics)는 생활 방식으로 인한 체중 감소 후 장 염증 감소 및 미생물 대사 변화를 보여줍니다. 생체분자, 11(5), 5조. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, T. S., Shanahan, F., & O'Toole, P. W. (2022). 건강한 노화의 조절자로서의 장내 미생물군집. 자연 리뷰 위장병학 및 간장학, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R., & Schmidt, M. (2023). DIA-PASEF 메타프로테오믹스를 통한 숙주-미생물 상호작용의 분류학적 및 기능적 특성 분석이 증가합니다. 미생물학의 프론티어, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L., Musaad, S. M., & Holscher, H. D. (2017). 하루 중 시간과 식습관은 인간 위장 미생물총의 구성 및 기능과 관련이 있습니다. 미국 임상 영양 저널, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P., & Becher, D. (2019). 샘플 보존 및 보관은 인간 장내 미생물군유전체에 대한 메타프로테오믹스 연구에서 분류학적 및 기능적 프로필에 상당한 영향을 미칩니다. 미생물, 7(9), 9조. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A., & de Vos, W. M. (2016). 대변 ​​메타프로테옴 분석은 개인화되고 안정적인 기능성 미생물군집과 성인에 대한 프로바이오틱스 개입의 제한된 효과를 보여줍니다. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). 대규모 연관성 분석을 통해 인간 장내 미생물 구성에 영향을 미치는 숙주 요인을 식별합니다. 자연 유전학, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, G. T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C., & Chan, A. T. (2018). 성인 남성 집단에서 인간 배설물 미생물 군집의 안정성. 자연 미생물학, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 모던트, A., & 클라이너, M.(2021). 장내 미생물군집의 Metaproteomics 분석을 위한 시료 보존 및 보관 방법의 평가. 미생물학 스펙트럼, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 니스, E.C.(2022). 2020년대를 맞이하는 단백질체학의 위상: 개인화/정밀의료를 향하여. 분석 생화학, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D. S., & Taslim, N. A. (2022). 장내 미생물군집의 인간 활동과 변화: 관점. 인간 영양 및 대사, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, S. A., Ning, Z., Starr, A. E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A., & Figeys, D. (2018). Metaproteomics는 소아 염증성 장 질환에서 미생물군집과 장내 세포밖 소포체 단백질 사이의 연관성을 밝힙니다. 네이처 커뮤니케이션즈, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4