Undersøgelse af effektiviteten af ​​lagerbuffere i kommercielle stadier og evaluering af tarmmetaproteomvariabilitet mellem individer (PROTEGI)

A. Introduktion:

Metaproteomics studerer hele proteinkomplementet i et mikrobielt samfund og giver indsigt i indviklede økosystemer som tarmmikrobiomet. Metaproteomics giver forskere mulighed for at dykke dybt ned i tarmmikrobiomer, hvilket giver indsigt i disse mikrobielle indbyggeres overflod og funktionelle aktiviteter. Denne viden har været medvirkende til at belyse de mekanismer, der ligger til grund for forskellige sygdomme, såsom inflammatorisk tarmsygdom (Zhang et al., 2018) og fedme (Biemann et al., 2021). Forskere kan udvikle målrettede strategier for personlig medicin og præcisionssundhedspleje baseret på den underliggende biologi (Nice, 2022) ved at identificere vigtige proteinsignaturer.

I tarmmikrobiomundersøgelser er standardiseret prøveindsamling og -bevaring særligt afgørende for at bevare integriteten af ​​det mikrobielle samfund og dets proteom. For at opnå pålidelige resultater skal det faktisk betragtes som følsomheden over for miljøpåvirkninger som temperatur og iltmængde. Til metaproteomiske undersøgelser af tarmmikrobiom foretrækkes ikke-invasive eller minimalt invasive metoder for at minimere forstyrrelser eller kontaminering og bevare den native mikrobielle sammensætning og proteinprofiler. Også prøvehåndterings- og opbevaringsstrategierne påvirker nedbrydningen af ​​proteiner og den mikrobielle populationsstabilitet. Af denne grund anbefales omgående nedfrysning eller konservering ved lave temperaturer (f.eks. -80°C) ofte for at opretholde prøvens integritet indtil analyse (Hickl et al., 2019). Brug af en kølekæde til opbevaring og transport er imidlertid ikke foreneligt med en prøveudtagningsstrategi på stedet, som er nødvendig for store og delokaliserede undersøgelser. Desuden er det mindre ideelt, dyrere og logistisk kedeligt end potentielle rumtemperaturmuligheder.

Ydermere er den nuværende viden om metoderne til indsamling/konservering af fækal prøve baseret på konservering af nukleinsyrer eller metabolitter under transporten til laboratoriet for analyse. Proteinkonservering kræver imidlertid forskellige strategier, og undersøgelser er knappe og er afhængige af at adoptere de enheder eller reagenser, der bruges i tilfælde af nukleinsyre- eller metabolitteranalyse (Mordant & Kleiner, 2021). Derfor er skræddersyede og standardiserede protokoller sammen med metadataindsamling afgørende for at sikre reproducerbarhed og sammenlignelighed på tværs af metaproteomiske undersøgelser.

Denne undersøgelse har til formål at evaluere egnetheden af ​​flere kommercielle og ikke-farlige buffere til opbevaring af humane tarmfækale prøver over tid. Fækale prøver vil blive opbevaret i fem forskellige buffere og vil blive benchmarket med direkte frosne prøver. Ved hjælp af metaproteomics vil vi sammenligne de proteomiske, taksonomiske og funktionelle identifikationer for at forstå potentialet af disse buffere som en pålidelig opbevaringsløsning til menneskelig afføring. Denne forskning er unik, og så vidt vi ved, har ingen lignende undersøgelse behandlet dette krævende spørgsmål.

Foreløbige beviser hos mennesker har vist inter- og intra-individuel variabilitet af værtens proteomer og mikrobiomer (Mehta et al., 2018). Især den intra-individuelle taksonomiske og funktionelle variation i tarmmikrobiomet synes at være lavere end inter-individuell variation over tid. Imidlertid udviste metatranskriptomiske profiler sammenlignelig variabilitet inden for og mellem forsøgspersoner. Derfor, ved hjælp af metaproteomics, sigter vi mod at vurdere de inter- og intra-individuelle variationer på proteomniveau ved at studere fækale prøver med jævne mellemrum indsamlet fra deltagere.

B. Den akademiske og sociale relevans:

Den første del af undersøgelsen har til formål at definere den mest effektive opbevaringsbuffer til at bevare proteinintegriteten under prøvetransport fra samlingsstedet til behandlingsstedet - en nøglefaktor i fremtiden for metaproteomik anvendt på sundhed og sygdom. På trods af dens betydning er en lignende evaluering ikke blevet udført for proteomiske applikationer. Denne viden vil være afgørende for akademiske formål, der skal bruges til storstilede humane fækale proteomiske undersøgelser. For at folk kan få deres tarmsundhed undersøgt gennem metaproteomik og frigøre potentialet i mikrobielle samfundsbaseret personlig medicin og terapeutiske interventioner, vil der være et krav om konsekvent prøveindsamling, og denne undersøgelse vil give det.

Den anden del af undersøgelsen er designet til at forstå den variabilitet, der kan observeres i tarmmikrobiomets sammensætning og funktioner fra et proteomisk perspektiv. Tarmmikrobiomet er dynamisk og er kendt for at blive ændret af flere faktorer såsom kost (Kolmeder et al., 2016), alder (Ghosh et al., 2022), genetik (Kurilshikov et al., 2021), miljø (Nurkolis et al. al., 2022), osv. Disse variationer kan bredt klassificeres i inter- og intra-individuelle. Inter-individuel variabilitet refererer til de forskelle, der observeres mellem individer inden for en befolkning eller gruppe, og de kan omfatte en bred vifte af karakteristika, herunder genetisk sammensætning, fysiologiske parametre, livsstilsfaktorer og miljøeksponeringer. Forståelse af interindividuel variabilitet fra mennesker fra det samme "samfund" er afgørende inden for områder som personlig medicin, hvor skræddersyede interventioner tager højde for individuelle forskelle for at optimere behandlingsresultater. Intra-individuel variabilitet refererer på den anden side til variationer observeret inden for det samme individ over tid eller under forskellige forhold og kan opstå fra biologiske fluktuationer, såsom døgnrytmer, hormonelle fluktuationer eller fysiologiske reaktioner på stimuli. Genkendelse og karakterisering af intra-individuel variabilitet er afgørende for nøjagtig fortolkning af forskningsresultater og vurdering af pålideligheden af ​​biologiske målinger, især i longitudinelle undersøgelser eller kliniske monitoreringsscenarier. Denne undersøgelse har til formål at forstå disse variationer gennem de proteomiske data indsamlet fra deltagernes fækale prøver og definere de variabler, der er påvist i tarmmikrobiomet.

C. Mål:

1. At identificere effekten af ​​fem forskellige buffere, der bruges til opbevaring og transport af opsamlet humant fækalt materiale, ved hjælp af metaproteomiske profiler.
2. At bestemme variabiliteten i mikrobiota og værtsproteomer på inter- og intra-individuelle niveauer.

D. Studiedesign:

I den første fase vil vi implementere følgende protokol til fækal prøvetagning og transportkonservering på stedet: Deltagerne (rekrutteret blandt medlemmerne af vores laboratorium/afdeling) vil blive forsynet med 18 rør (nummereret 1-18; 15 ml konisk centrifuge rør; Ref# 339650, Thermo Scientific og 18 letanvendelige kommercielle vatpinde (C1052-50, Zymo Research) eller spatler (DNAGenotek). De 18 rør svarer til tre opbevaringstidspunkter for 6 forskellige eksperimentelle forhold: et tomt rør (uden konserveringsvæske) som kontrolprøve og 5 forskellige ikke-farlige fækale konserveringsvæsker: (a) In-house buffer (kaldet LB) med SDS og urinstof, kommercielt opnået (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) Copan Amies buffer (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). Kort fortalt er LB, Zymo Shield og OM200 kendt for at indeholde detergenter, der hjælper med at bevare biomolekylerne, Copan Amies buffer er et næringsfrit medie, der er kendt for at holde cellerne levedygtige og vist sig at have applikationer i kulturomik, og ME200 er opløsningsmiddelbaseret nyttigt. i metabolomiske applikationer. Derudover vil deltagerne modtage en kommerciel afføringsfanger, der vises over toilettet for at lette fækal prøveudtagning (Servoprax Stuhlfaenger, referencenummer H7 61000-50 fra www.medundorg.de) og en lille æske med isposer, hvori de tre Controller prøver vil blive opbevaret og transporteret til laboratoriet. Disse isoplagrede kontrolprøver er nøglen til at evaluere ydeevnen af ​​de forskellige lagerbuffere. Deltagerne vil bringe prøverne til vores laboratorium inden for de følgende 24 timer. Ved modtagelse i laboratoriet vil kontrolprøverne blive opbevaret ved -80°C indtil videre biokemisk behandling ved hjælp af etablerede protokoller (Gómez-Varela et al., 2023). Resten af ​​prøverne vil blive opbevaret ved +20°C inde i en orbital shaker inkubator i i alt 2, 5 og 10 dage (simulering af forskellige opbevarings-/transporttider deraf). Ved afslutningen af ​​disse tidspunkter vil prøverne blive opbevaret ved -80°C indtil videre biokemisk behandling ved hjælp af etablerede protokoller (Gómez-Varela et al., 2023). De metaproteomiske profiler (som angiver de taksonomiske og funktionelle ændringer i tarmmikrobiomet og værtsfysiologien; som i Gomez-Varela, 2023 fra disse prøver vil informere os om den bedste konserveringsvæske (defineret som den, hvor mikrobiomets sammensætning og funktion er mere ligesom kontrolprøven). Dette eksperiment er nødvendigt for at påbegynde fase II af undersøgelsen, og det er nyt på området, da der ikke er etableret retningslinjer for bedste interne fækal prøveudtagningspraksis inden for metaproteomik. Seks raske deltagere (blandt medlemmerne af System Biology of Pain-laboratoriet, Afdelingen for Farmakologi og Toksikologi, Institut for Farmaceutiske Videnskaber) vil blive rekrutteret. Dette er et randomiseret studie uden deltagergrupper. Prøver vil blive indsamlet én gang og fordelt på 18 rør, der repræsenterer forskellige forhold. En prøvestørrelse på 6 forsøgspersoner vil være nok til at finde den bedste konserveringsløsning, og prøveudtagningen vil blive udført én gang under normal afføring af deltagerne. Derudover vil deltagerne udfylde et spørgeskema (vedhæftet), der indeholder oplysninger som alder, køn, kropsmasseindeks, GSRS-skalaen for gastrointestinale symptomer), administration af antibiotika inden for de sidste 30 dage før prøvetagning, Bristol afføringsformularen skala (BSFS), og den omtrentlige tid, der er nødvendig for prøveopsamling i de 18 rør (for at tage højde for potentielle effekter som følge af oxidationsprocesser).

I den anden fase forventes deltagerne at indsamle fæcesprøver i 4 uger under deres regelmæssige afføring (maks. ti forskellige gange). De vil blive forsynet med et passende antal 15 ml koniske centrifugerør (339650, Thermo Scientific) indeholdende den bedst ydende konserveringsbuffer (som defineret i første fase af undersøgelsen, se ovenfor) og en kommerciel opsamlingsanordning med en afføringsfanger . Ved modtagelse i laboratoriet vil prøverne blive opbevaret ved -80°C indtil videre biokemisk behandling ved hjælp af etablerede protokoller. Derudover vil deltagerne udfylde et spørgeskema (se ovenfor). Deltagerne vil deltage frivilligt i eksperimentet efter at have modtaget en forklaring på alle risici og fordele ved at deltage i denne undersøgelse og efter at have underskrevet den skriftlige informerede samtykkeformular i henhold til Helsinki-erklæringen (se samtykkeformularen, vedhæftet). Deltagerne vil blive instrueret og forsynet med nødvendige prøveudtagningsudstyr til at indsamle afføringsprøver (se ovenfor) og indsende prøverne til Institut for Farmakologi og Toksikologi ved førstkommende lejlighed. Deltagerne forventes at udfylde selvadministrerede spørgeskemaer, der indeholder information som den, der er beskrevet ovenfor. Til den anden fase vil 46 raske deltagere (blandt medlemmerne af vores laboratorium/afdeling) blive rekrutteret fra begge køn (23 mænd og kvinder) i betragtning af en mulig frafaldsrate på 20 %. Dette er et randomiseret studie uden deltagergrupper. Stikprøvestørrelsen blev beregnet baseret på tærsklen for Eggertella-estimater med tid rapporteret af Kaczmarek et al., 2017. Den anvendte statistikprocedure er F-tests - to-vejs ANOVA med gentagne mål med følgende værdier Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 og α=0,05. Der forventes at blive indsamlet i alt 400 - 460 prøver.

E. Referencer:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & Heyer, R. (2021). Fækal Metaproteomics afslører reduceret tarmbetændelse og ændret mikrobiel metabolisme efter livsstils-induceret vægttab. Biomolecules, 11(5), artikel 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, T.S., Shanahan, F., & O'Toole, P.W. (2022). Tarmmikrobiomet som en modulator af sund aldring. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R., & Schmidt, M. (2023). Forøgelse af taksonomisk og funktionel karakterisering af vært-mikrobiom-interaktioner ved DIA-PASEF-metaproteomik. Frontiers in Microbiology, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L., Musaad, S. M., & Holscher, H. D. (2017). Tid på dagen og spiseadfærd er forbundet med sammensætningen og funktionen af ​​den menneskelige gastrointestinale mikrobiota. The American Journal of Clinical Nutrition, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P., & Becher, D. (2019). Prøvebevarelse og -opbevaring har betydelig indflydelse på taksonomiske og funktionelle profiler i metaproteomiske undersøgelser af det menneskelige tarmmikrobiom. Microorganisms, 7(9), artikel 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A., & de Vos, W. M. (2016). Fækal metaproteomisk analyse afslører et personligt og stabilt funktionelt mikrobiom og begrænsede virkninger af en probiotisk intervention hos voksne. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Storstilede associationsanalyser identificerer værtsfaktorer, der påvirker sammensætningen af ​​menneskets tarmmikrobiom. Nature Genetics, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, G. T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C., & Chan, A. T. (2018). Stabilitet af det menneskelige fækale mikrobiom i en kohorte af voksne mænd. Nature Microbiology, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A., & Kleiner, M. (2021). Evaluering af prøvekonservering og -opbevaringsmetoder til metaproteomisk analyse af tarmmikrobiomer. Microbiology Spectrum, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nice, E. C. (2022). Status for proteomics, når vi går ind i 2020'erne: Mod personlig/præcisionsmedicin. Analytical Biochemistry, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D.S., & Taslim, N.A. (2022). Menneskelige aktiviteter og ændringer i tarmmikrobiomet: Et perspektiv. Human Nutrition & Metabolism, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, S. A., Ning, Z., Starr, A. E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A., & Figeys, D. (2018). Metaproteomics afslører associationer mellem mikrobiom og intestinale ekstracellulære vesikelproteiner i pædiatrisk inflammatorisk tarmsygdom. Nature Communications, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4