Исследование эффективности коммерческих буферов для хранения стадий и оценка вариабельности кишечных метапротеомов между людьми (PROTEGI)

А. Введение:

Метапротеомика изучает весь белковый состав микробного сообщества и дает представление о сложных экосистемах, таких как кишечный микробиом. Метапротеомика позволяет исследователям глубоко вникать в микробиомы кишечника, давая представление о численности и функциональной активности этих микробных обитателей. Эти знания сыграли важную роль в выяснении механизмов, лежащих в основе различных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника (Zhang et al., 2018) и ожирение (Biemann et al., 2021). Исследователи могут разрабатывать целевые стратегии персонализированной медицины и точного здравоохранения на основе базовой биологии (Ницца, 2022), идентифицируя ключевые сигнатуры белков.

В исследованиях микробиома кишечника стандартизированный сбор и сохранение образцов особенно важны для сохранения целостности микробного сообщества и его протеома. Действительно, для получения надежных результатов необходимо учитывать восприимчивость к воздействиям окружающей среды, таким как температура и количество кислорода. Для метапротеомных исследований микробиома кишечника предпочтительны неинвазивные или минимально инвазивные методы, чтобы свести к минимуму разрушение или загрязнение и сохранить нативный микробный состав и белковые профили. Кроме того, стратегии обработки и хранения образцов влияют на деградацию белков и стабильность микробной популяции. По этой причине часто рекомендуется немедленное замораживание или сохранение при низких температурах (например, -80°C) для сохранения целостности проб до анализа (Hickl et al., 2019). Однако использование холодовой цепи для хранения и транспортировки несовместимо со стратегией отбора проб на месте, которая необходима для крупномасштабных и делокализованных исследований. Более того, он менее идеален, более дорог и утомителен с точки зрения логистики, чем потенциальные варианты комнатной температуры.

Кроме того, современные знания о методах сбора/сохранения образцов фекалий основаны на сохранении нуклеиновых кислот или метаболитов во время транспортировки в лабораторию для анализа. Однако сохранение белков требует разных стратегий, а исследований мало, и они полагаются на использование устройств или реагентов, используемых в случае анализа нуклеиновых кислот или метаболитов (Mordant & Kleiner, 2021). Таким образом, адаптированные и стандартизированные протоколы вместе со сбором метаданных необходимы для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости метапротеомных исследований.

Настоящее исследование направлено на оценку пригодности нескольких коммерческих и неопасных буферов для хранения образцов фекалий кишечника человека с течением времени. Образцы фекалий будут храниться в пяти различных буферах и будут сравниваться с образцами непосредственно замороженными. Используя метапротеомику, мы сравним протеомную, таксономическую и функциональную идентификацию, чтобы понять потенциал этих буферов как надежного решения для хранения человеческих фекалий. Это исследование уникально, и, насколько нам известно, ни одно подобное исследование не рассматривало этот сложный вопрос.

Предварительные данные на людях показали меж- и внутрииндивидуальную изменчивость протеомов хозяина и микробиомов (Mehta et al., 2018). В частности, внутрииндивидуальные таксономические и функциональные вариации микробиома кишечника, по-видимому, ниже, чем межиндивидуальные вариации с течением времени. Однако профили метатранскриптомики демонстрировали сопоставимую вариабельность внутри и между субъектами. Поэтому, используя метапротеомику, мы стремимся оценить меж- и внутрииндивидуальные изменчивости на уровне протеома, изучая образцы фекалий, периодически собираемые у участников.

Б. Академическая и социальная значимость:

Первая часть исследования направлена ​​на определение наиболее эффективного буфера для хранения для сохранения целостности белка во время транспортировки образцов от места сбора к месту обработки – ключевого фактора в будущем метапротеомики, применяемой к здоровью и болезням. Несмотря на важность, подобная оценка не проводилась для протеомных приложений. Эти знания будут иметь решающее значение для академических целей и использоваться для крупномасштабных исследований протеомики фекалий человека. Чтобы люди могли проверить здоровье своего кишечника с помощью метапротеомики и раскрыть потенциал персонализированной медицины и терапевтических вмешательств на основе микробных сообществ, потребуется последовательный сбор образцов, и это исследование обеспечит это.

Вторая часть исследования призвана понять изменчивость, которую можно наблюдать в составе и функциях микробиома кишечника с точки зрения протеомики. Микробиом кишечника является динамичным и, как известно, изменяется под действием множества факторов, таких как диета (Kolmeder et al., 2016), возраст (Ghosh et al., 2022), генетика (Курильщиков и др., 2021), окружающая среда (Nurkolis et al., 2022). др., 2022) и др. Эти вариации можно разделить на меж- и внутрииндивидуальные. Межиндивидуальная изменчивость относится к различиям, наблюдаемым между людьми внутри популяции или группы, и они могут охватывать широкий спектр характеристик, включая генетический состав, физиологические параметры, факторы образа жизни и воздействие окружающей среды. Понимание межиндивидуальной изменчивости у людей одного и того же «сообщества» имеет важное значение в таких областях, как персонализированная медицина, где индивидуальные вмешательства учитывают индивидуальные различия для оптимизации результатов лечения. С другой стороны, внутрииндивидуальная изменчивость относится к вариациям, наблюдаемым у одного и того же человека с течением времени или в разных условиях, и может возникать в результате биологических колебаний, таких как циркадные ритмы, гормональные колебания или физиологические реакции на раздражители. Распознавание и характеристика внутрииндивидуальной изменчивости имеет решающее значение для точной интерпретации результатов исследований и оценки надежности биологических измерений, особенно в продольных исследованиях или сценариях клинического мониторинга. Целью этого исследования является понимание этих различий с помощью протеомных данных, собранных из образцов фекалий участников, и определение переменных, обнаруженных в микробиоме кишечника.

С. Цели:

1. Определить эффект пяти различных буферов, используемых для хранения и транспортировки собранного фекального материала человека, по метапротеомным профилям.
2. Определить изменчивость микробиоты и протеомов хозяина на меж- и внутрииндивидуальном уровнях.

D. Дизайн исследования:

На первом этапе мы будем применять следующий протокол для отбора проб фекалий на месте и их хранения при транспортировке: Участникам (набранным из числа сотрудников нашей лаборатории/отдела) будет предоставлено 18 пробирок (с номерами 1–18; коническая центрифуга на 15 мл). пробирки № 339650, Thermo Scientific и 18 простых в использовании коммерческих тампонов (C1052-50, Zymo Research) или шпателей (DNAGenotek). 18 пробирок соответствуют трем точкам времени хранения 6 различных экспериментальных условий: пустая пробирка (без консервирующей жидкости) в качестве контрольного образца и 5 различных неопасных жидкостей для консервации фекалий: (а) Собственный буфер (называемый LB) с SDS и мочевина, коммерчески полученная (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) буфер Copan Amies (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet • КИШЕЧНИК (МЕ200, ДНКГенотек). Вкратце, известно, что LB, Zymo Shield и OM200 содержат детергенты, которые помогают сохранить биомолекулы, буфер Copan Amies представляет собой среду, не содержащую питательных веществ, которая, как известно, сохраняет клетки жизнеспособными и, как показано, находит применение в культуромике, а ME200 полезен на основе растворителей. в метаболомных приложениях. Кроме того, участники получат коммерческий уловитель стула, который будет выставлен над унитазом для облегчения отбора проб фекалий (Servoprax Stuhlfaenger, номер H7 61000-50 на сайте www.medundorg.de) и небольшую коробку с пакетами льда, в которых будут храниться три контрольных образца. образцы будут храниться и транспортироваться в лабораторию. Эти хранящиеся во льду контрольные образцы являются ключом к оценке производительности различных буферов хранения. Участники доставят образцы в нашу лабораторию в течение следующих 24 часов. После поступления в лабораторию контрольные образцы будут храниться при температуре -80°C до дальнейшей биохимической обработки по установленным протоколам (Gómez-Varela et al., 2023). Остальные образцы будут храниться при +20°C внутри инкубатора с орбитальным шейкером в общей сложности 2, 5 и 10 дней (имитируя различные сроки хранения/транспортировки). По истечении этих временных точек образцы будут храниться при температуре -80°C до дальнейшей биохимической обработки с использованием установленных протоколов (Gómez-Varela et al., 2023). Метапротеомные профили (указывающие таксономические и функциональные изменения в микробиоме кишечника и физиологии хозяина; как в случае с Гомесом-Варелой, 2023 г.), полученные из этих образцов, проинформируют нас о лучшей консервирующей жидкости (определяемой как та, в которой состав и функции микробиома более эффективны). как контрольный образец). Этот эксперимент необходим для начала фазы II исследования, и он является новинкой в ​​этой области, поскольку не установлено никаких руководящих принципов для лучших внутренних методов отбора проб фекалий в метапротеомике. Будут набраны шесть здоровых участников (среди сотрудников лаборатории системной биологии боли отдела фармакологии и токсикологии факультета фармацевтических наук). Это рандомизированное исследование без групп участников. Пробы будут собраны один раз и распределены по 18 пробиркам, представляющим разные условия. Размер выборки из 6 субъектов будет достаточен, чтобы найти наилучшее решение для консервации, и отбор проб будет осуществляться один раз при нормальном опорожнении кишечника участниками. Кроме того, участники заполнят анкету (прилагается), которая включает такую ​​информацию, как возраст, пол, индекс массы тела, шкалу оценки желудочно-кишечных симптомов (GSRS), прием антибиотиков за последние 30 дней до сбора образцов, бристольскую форму стула. масштаб (BSFS) и приблизительное время, необходимое для сбора проб в 18 пробирках (для учета потенциальных эффектов, связанных с процессами окисления).

На втором этапе участники должны будут собирать образцы фекалий в течение 4 недель во время регулярной дефекации (максимум десять раз). Им будет предоставлено достаточное количество конических центрифужных пробирок емкостью 15 мл (339650, Thermo Scientific), содержащих наиболее эффективный буфер для консервации (как определено на первом этапе исследования, см. выше), а также коммерческое устройство для сбора фекалий. . При поступлении в лабораторию образцы будут храниться при температуре -80°С до дальнейшей биохимической обработки по установленным протоколам. Кроме того, участники заполнят анкету (см. выше). Участники примут участие в эксперименте добровольно после получения объяснения всех рисков и преимуществ участия в настоящем исследовании и после подписания письменной формы информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией (см. форму согласия, прилагаемую). Участники будут проинструктированы и обеспечены необходимыми устройствами для отбора проб стула (см. выше) и представят образцы в отделение фармакологии и токсикологии при первой же возможности. Ожидается, что участники заполнят анкеты, заполняемые самостоятельно, которые включают информацию, подобную описанной выше. Для второго этапа будут набраны 46 здоровых участников (из числа сотрудников нашей лаборатории/отделения) обоих полов (23 мужчины и женщины) с учетом возможного процента отсева в 20%. Это рандомизированное исследование без групп участников. Размер выборки был рассчитан на основе пороговых оценок Eggerthella с учетом времени, о которых сообщает Kaczmarek et al., 2017. Используемая статистическая процедура представляет собой F-тесты - двусторонний дисперсионный анализ с повторными измерениями со следующими значениями Cohens'd = 0,75, 1-β = 0,80 и α = 0,05. Всего планируется собрать 400-460 проб.

Е. Ссылки:

Биман Р., Бусс Э., Бенндорф Д., Леманн Т., Шаллерт К., Пютткер С., Райхл У., Изерманн Б., Шнайдер Дж. Г., Сааке Г. и Хейер, Р. (2021). Фекальная метапротеомика показывает уменьшение воспаления кишечника и изменение микробного метаболизма после потери веса, вызванной образом жизни. Биомолекулы, 11(5), статья 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726. Гош Т.С., Шанахан Ф. и О'Тул П.В. (2022). Микробиом кишечника как модулятор здорового старения. Nature Reviews Гастроэнтерология и гепатология, 19 (9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Гомес-Варела Д., Сиань Ф., Грундтнер С., Зондерманн Дж. Р. и Шмидт М. (2023). Расширение таксономических и функциональных характеристик взаимодействий хозяина и микробиома с помощью метапротеомики DIA-PASEF. Границы микробиологии, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703. Качмарек Дж. Л., Мусаад С. М. и Холшер Х. Д. (2017). Время суток и пищевое поведение связаны с составом и функцией желудочно-кишечной микробиоты человека. Американский журнал клинического питания, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Хикль О., Хайнц-Бушар А., Траутвейн-Шульт А., Херцог Р., Борк П., Вильмс П. и Бехер Д. (2019). Консервация и хранение образцов существенно влияют на таксономические и функциональные профили в метапротеомических исследованиях микробиома кишечника человека. Микроорганизмы, 7(9), Статья 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367. Кольмедер, К.А., Салоярви, Дж., Ритари, Дж., де Бин, М., Раес, Дж., Фалони, Г., Виейра-Сильва, С., Кекконен, Р.А., Корталс, Г.Л., Палва, А., Салонен А. и де Вос В.М. (2016). Метапротеомный анализ кала выявляет персонализированный и стабильный функциональный микробиом и ограниченные эффекты применения пробиотиков у взрослых. ПлоС Один, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Курильщиков А., Медина-Гомез К., Бачигалупе Р., Раджабзаде Д., Ван Дж., Демиркан А., Ле Рой К. И., Райгоза Гарай Х. А., Финникум К. Т., Лю Х. , Жернакова Д.В., Бондер М.Дж., Хансен Т.Х., Фрост Ф., Рюлеманн М.К., Терпин В., Мун Ж.-Ю., Ким Х.-Н., Люлль К., … Жернакова , А. (2021). Крупномасштабный анализ ассоциаций идентифицирует факторы хозяина, влияющие на состав микробиома кишечника человека. Природная генетика, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Мехта, Р.С., Абу-Али, Г.С., Дрю, Д.А., Ллойд-Прайс, Дж., Субраманиан, А., Локхед, П., Джоши, А.Д., Айви, К.Л., Халили, Х., Браун, Дж.Т., ДюЛонг, К., Сонг М., Нгуен Л.Х., Маллик Х., Римм Э.Б., Изард Дж., Хаттенхауэр К. и Чан А.Т. (2018). Стабильность фекального микробиома человека в когорте взрослых мужчин. Природная микробиология, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Мордант А. и Кляйнер М. (2021). Оценка методов консервации и хранения образцов для метапротеомного анализа кишечных микробиомов. Микробиологический спектр, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Ницца, EC (2022). Статус протеомики на пороге 2020-х годов: на пути к персонализированной/прецизионной медицине. Аналитическая биохимия, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Нурколис Ф., Маюлу Н., Ясмин Н., Пушпанингтяс Д.С. и Таслим Н.А. (2022). Деятельность человека и изменения в микробиоме кишечника: перспектива. Питание человека и обмен веществ, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Чжан, К., Дик, С.А., Нин, З., Старр, А.Е., Батчер, Дж., Ли, Дж., Мейн, Дж., Ченг, К., Ляо, Б., Ли, Л., Синглтон, Р., Мак Д., Стинци А. и Фигейс Д. (2018). Метапротеомика выявляет связь между микробиомом и белками кишечных внеклеточных везикул при воспалительных заболеваниях кишечника у детей. Природные коммуникации, 9 (1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4