Badanie skuteczności komercyjnych buforów do przechowywania na etapie rozwoju i ocena zmienności metaproteomów jelitowych u poszczególnych osób (PROTEGI)

A. Wprowadzenie:

Metaproteomika bada cały zestaw białek społeczności drobnoustrojów i zapewnia wgląd w skomplikowane ekosystemy, takie jak mikrobiom jelitowy. Metaproteomika pozwala naukowcom zagłębić się w mikrobiomy jelitowe, dostarczając wglądu w liczebność i aktywność funkcjonalną tych mikrobiologicznych mieszkańców. Wiedza ta odegrała kluczową rolę w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw różnych chorób, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (Zhang i in., 2018) i otyłość (Biemann i in., 2021). Naukowcy mogą opracować ukierunkowane strategie medycyny spersonalizowanej i precyzyjnej opieki zdrowotnej w oparciu o biologię (Nicea, 2022), identyfikując kluczowe sygnatury białkowe.

W badaniach mikrobiomu jelitowego standaryzowane pobieranie i konserwacja próbek ma szczególne znaczenie dla zachowania integralności społeczności drobnoustrojów i jej proteomu. Rzeczywiście, aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy wziąć pod uwagę podatność na wpływy środowiska, takie jak temperatura i ilość tlenu. W przypadku badań metaproteomicznych mikrobiomu jelitowego preferowane są metody nieinwazyjne lub minimalnie inwazyjne, aby zminimalizować zakłócenia lub skażenie oraz zachować natywny skład mikrobiologiczny i profile białkowe. Ponadto strategie postępowania z próbkami i ich przechowywania wpływają na degradację białek i stabilność populacji drobnoustrojów. Z tego powodu często zaleca się natychmiastowe zamrożenie lub konserwację w niskich temperaturach (np. -80°C), aby zachować integralność próbki do czasu analizy (Hickl i in., 2019). Jednakże stosowanie łańcucha chłodniczego do przechowywania i transportu nie jest zgodne ze strategią pobierania próbek na miejscu, która jest niezbędna w przypadku badań na dużą skalę i zdelokalizowanych. Co więcej, jest to mniej idealne, droższe i logistycznie uciążliwe niż potencjalne opcje w temperaturze pokojowej.

Co więcej, obecna wiedza na temat metod pobierania/konserwowania próbek kału opiera się na konserwowaniu kwasów nukleinowych lub metabolitów podczas transportu do laboratorium w celu analizy. Jednak konserwacja białek wymaga różnych strategii, a badań jest niewiele i opierają się na przyjęciu urządzeń lub odczynników stosowanych w przypadku analizy kwasów nukleinowych lub metabolitów (Mordant i Kleiner, 2021). Zatem dostosowane i ustandaryzowane protokoły wraz z gromadzeniem metadanych są niezbędne do zapewnienia odtwarzalności i porównywalności badań metaproteomicznych.

Niniejsze badanie ma na celu ocenę przydatności kilku dostępnych na rynku i bezpiecznych buforów do przechowywania próbek ludzkiego kału jelitowego w czasie. Próbki kału będą przechowywane w pięciu różnych buforach i będą porównywane z próbkami bezpośrednio zamrożonymi. Korzystając z metaproteomiki, porównamy identyfikację proteomiczną, taksonomiczną i funkcjonalną, aby zrozumieć potencjał tych buforów jako niezawodnego rozwiązania do przechowywania ludzkich odchodów. To badanie jest wyjątkowe i zgodnie z naszą najlepszą wiedzą żadne podobne badanie nie dotyczyło tego wymagającego pytania.

Wstępne dowody na ludziach wykazały między- i wewnątrzosobniczą zmienność proteomów gospodarza i mikrobiomów (Mehta i in., 2018). W szczególności wewnątrzosobnicza zmienność taksonomiczna i funkcjonalna mikrobiomu jelitowego wydaje się być mniejsza niż zmienność międzyosobnicza w czasie. Jednakże profile metatranskryptomiczne wykazywały porównywalną zmienność w obrębie osobników i pomiędzy nimi. Dlatego też, korzystając z metaproteomiki, naszym celem jest ocena zmienności między- i wewnątrzosobniczej na poziomie proteomu, poprzez badanie próbek kału pobieranych okresowo od uczestników.

B. Znaczenie akademickie i społeczne:

Pierwsza część badania ma na celu zdefiniowanie najskuteczniejszego buforu do przechowywania w celu zachowania integralności białka podczas transportu próbki z miejsca pobrania do miejsca przetwarzania – co jest kluczowym czynnikiem w przyszłości metaproteomiki stosowanej w zdrowiu i chorobie. Pomimo jego znaczenia, podobnej oceny nie przeprowadzono pod kątem zastosowań proteomicznych. Wiedza ta będzie miała kluczowe znaczenie dla celów akademickich i zostanie wykorzystana w badaniach proteomiki ludzkiego kału na dużą skalę. Aby ludzie mogli poddać się badaniu stanu jelit za pomocą metaproteomiki i uwolnić potencjał medycyny spersonalizowanej i interwencji terapeutycznych opartych na społecznościach drobnoustrojów, konieczne będzie spójne pobieranie próbek, co zapewni to badanie.

Druga część badania ma na celu zrozumienie zmienności, jaką można zaobserwować w składzie i funkcjonowaniu mikrobiomu jelitowego z perspektywy proteomiki. Mikrobiom jelitowy jest dynamiczny i wiadomo, że zmienia się pod wpływem wielu czynników, takich jak dieta (Kolmeder i in., 2016), wiek (Ghosh i in., 2022), genetyka (Kurilshikov i in., 2021), środowisko (Nurkolis i in. in., 2022) itp. Różnice te można ogólnie podzielić na między- i wewnątrzosobnicze. Zmienność międzyosobnicza odnosi się do różnic obserwowanych między jednostkami w obrębie populacji lub grupy i może obejmować szeroki zakres cech, w tym strukturę genetyczną, parametry fizjologiczne, czynniki stylu życia i narażenie środowiskowe. Zrozumienie zmienności międzyosobniczej u osób z tej samej „społeczności” jest niezbędne w takich dziedzinach, jak medycyna personalizowana, gdzie dostosowane interwencje uwzględniają różnice indywidualne w celu optymalizacji wyników leczenia. Z drugiej strony zmienność wewnątrzosobnicza odnosi się do zmian obserwowanych u tej samej osoby na przestrzeni czasu lub w różnych warunkach i może wynikać z wahań biologicznych, takich jak rytmy dobowe, wahania hormonalne lub reakcje fizjologiczne na bodźce. Rozpoznanie i scharakteryzowanie zmienności wewnątrzosobniczej ma kluczowe znaczenie dla dokładnej interpretacji wyników badań i oceny wiarygodności pomiarów biologicznych, szczególnie w badaniach podłużnych lub scenariuszach monitorowania klinicznego. Celem tego badania jest zrozumienie tych zmienności na podstawie danych proteomicznych zebranych z próbek kału uczestników i zdefiniowanie zmiennych wykrywanych w mikrobiomie jelitowym.

C. Cele:

1. Identyfikacja wpływu pięciu różnych buforów stosowanych do przechowywania i transportu zebranego ludzkiego materiału kałowego za pomocą profili metaproteomicznych.
2. Określenie zmienności mikroflory i proteomów gospodarza na poziomie między- i wewnątrzosobniczym.

D. Projekt badania:

W pierwszym etapie będziemy wdrażać następujący protokół pobierania kału na miejscu i zabezpieczania transportu: Uczestnicy (rekrutowani spośród członków naszego laboratorium/oddziału) otrzymają 18 probówek (ponumerowanych 1-18; wirówka stożkowa 15 ml probówki; nr ref. 339650, Thermo Scientific i 18 łatwych w użyciu komercyjnych wacików (C1052-50, Zymo Research) lub szpatułek (DNAGenotek). 18 probówek odpowiada trzem momentom przechowywania w 6 różnych warunkach doświadczalnych: pusta probówka (bez płynu konserwującego) jako próbka kontrolna i 5 różnych, bezpiecznych płynów konserwujących kał: (a) Bufor wewnętrzny (zwany LB) z SDS i mocznik, dostępny na rynku (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) Bufor Copan Amies (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene·GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). W skrócie, wiadomo, że LB, Zymo Shield i OM200 zawierają detergenty, które pomagają zachować biomolekuły, bufor Copan Amies to niezawierające składników odżywczych podłoże, o którym wiadomo, że utrzymuje komórki przy życiu i które ma zastosowanie w kulturomice, a ME200 jest przydatny na bazie rozpuszczalnika w zastosowaniach metabolomicznych. Ponadto uczestnicy otrzymają komercyjny pojemnik na odchody, który będzie wywieszony nad toaletą w celu ułatwienia pobierania próbek kału (Servoprax Stuhlfaenger, numer referencyjny H7 61000-50 ze strony www.medundorg.de) oraz małe pudełko z okładami z lodu, w których trzy osoby z grupy kontrolnej próbki zostaną zapisane i przetransportowane do laboratorium. Te próbki kontrolne przechowywane w lodzie są kluczem do oceny wydajności różnych buforów do przechowywania. Uczestnicy przyniosą próbki do naszego laboratorium w ciągu kolejnych 24 godzin. Po przyjęciu do laboratorium próbki kontrolne będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu dalszego przetwarzania biochemicznego przy użyciu ustalonych protokołów (Gómez-Varela i in., 2023). Pozostałe próbki będą przechowywane w temperaturze +20°C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną łącznie przez 2, 5 i 10 dni (symulując różne czasy przechowywania/transportu). Po upływie tego czasu próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu dalszego przetwarzania biochemicznego przy użyciu ustalonych protokołów (Gómez-Varela i in., 2023). Profile metaproteomiczne (wskazujące zmiany taksonomiczne i funkcjonalne w mikrobiomie jelitowym oraz fizjologii gospodarza; podobnie jak w przypadku Gomez-Varela z 2023 r., z tych próbek poinformują nas o najlepszym płynie konserwującym (definiowanym jako taki, w którym skład i funkcja mikrobiomu są bardziej jak próbka kontrolna). Eksperyment ten jest niezbędny do rozpoczęcia II fazy badania i jest nowatorski w tej dziedzinie, ponieważ nie ustalono żadnych wytycznych dotyczących najlepszych wewnętrznych praktyk pobierania próbek kału w metaproteomice. Zrekrutowanych zostanie sześciu zdrowych uczestników (wśród członków laboratorium Biologii Systemów Bólu, Zakładu Farmakologii i Toksykologii, Wydziału Nauk Farmaceutycznych). Jest to badanie randomizowane, bez grup uczestników. Próbki zostaną pobrane jednorazowo i rozdzielone do 18 probówek reprezentujących różne warunki. Próbka licząca 6 osób będzie wystarczająca do znalezienia najlepszego rozwiązania konserwującego, a pobieranie próbek zostanie przeprowadzone jednorazowo, podczas normalnego wypróżnienia przez uczestników. Ponadto uczestnicy wypełnią kwestionariusz (w załączeniu), który będzie zawierał takie informacje, jak wiek, płeć, wskaźnik masy ciała, skala oceny objawów żołądkowo-jelitowych (GSRS), przyjmowanie antybiotyków w ciągu ostatnich 30 dni przed pobraniem próbki, formularz stolca typu Bristol. skalę (BSFS) oraz przybliżony czas potrzebny na pobranie próbki do 18 probówek (w celu uwzględnienia potencjalnych skutków procesów utleniania).

W drugiej fazie uczestnicy będą zbierać próbki kału przez 4 tygodnie podczas regularnej defekacji (maksymalnie dziesięciokrotnie). Zostaną wyposażeni w odpowiednią liczbę 15 ml stożkowych probówek wirówkowych (339650, Thermo Scientific) zawierających najskuteczniejszy bufor konserwujący (zgodnie z definicją w pierwszej fazie badania, patrz powyżej) oraz dostępne w handlu urządzenie do zbierania z pojemnikiem na kał . Po przyjęciu do laboratorium próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu dalszej obróbki biochemicznej zgodnie z ustalonymi protokołami. Dodatkowo uczestnicy wypełnią ankietę (patrz wyżej). Uczestnicy dobrowolnie wezmą udział w eksperymencie po otrzymaniu wyjaśnienia wszystkich zagrożeń i korzyści wynikających z udziału w niniejszym badaniu oraz po podpisaniu pisemnego formularza świadomej zgody zgodnie z Deklaracją Helsińską (patrz formularz zgody w załączeniu). Uczestnicy zostaną poinstruowani i wyposażeni w niezbędne urządzenia do pobierania próbek kału (patrz wyżej) i jak najszybsze przesłanie ich do Wydziału Farmakologii i Toksykologii. Od uczestników oczekuje się samodzielnego wypełnienia kwestionariuszy zawierających informacje podobne do opisanych powyżej. Do drugiej fazy zostanie zrekrutowanych 46 zdrowych uczestników (wśród członków naszego laboratorium/oddziału) obu płci (23 mężczyzn i kobiety), biorąc pod uwagę możliwy wskaźnik rezygnacji wynoszący 20%. Jest to badanie randomizowane, bez grup uczestników. Liczebność próby obliczono na podstawie progu szacunków Eggertella z czasem podanym przez Kaczmarka i in., 2017. Zastosowaną procedurą statystyczną są testy F – dwukierunkowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami z następującymi wartościami Cohensa = 0,75, 1-β = 0,80 i α = 0,05. Oczekuje się, że łącznie zostanie pobranych 400–460 próbek.

E. Referencje:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & Heyer, R. (2021). Metaproteomika kału ujawnia zmniejszony stan zapalny jelit i zmieniony metabolizm drobnoustrojów po utracie wagi spowodowanej stylem życia. Biomolecules, 11(5), artykuł 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, TS, Shanahan, F. i O'Toole, PW (2022). Mikrobiom jelitowy jako modulator zdrowego starzenia się. Nature Reviews Gastroenterologia i hepatologia, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R. i Schmidt, M. (2023). Zwiększanie taksonomicznej i funkcjonalnej charakterystyki interakcji gospodarz-mikrobiom za pomocą metaproteomiki DIA-PASEF. Granice w mikrobiologii, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L., Musaad, SM i Holscher, HD (2017). Pora dnia i zachowania żywieniowe są powiązane ze składem i funkcją ludzkiej mikroflory żołądkowo-jelitowej. American Journal of Clinical Nutrition, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P. i Becher, D. (2019). Konserwacja i przechowywanie próbek znacząco wpływa na profile taksonomiczne i funkcjonalne w badaniach metaproteomicznych ludzkiego mikrobiomu jelitowego. Mikroorganizmy, 7(9), artykuł 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A. i de Vos, WM (2016). Analiza metaproteomiki kału ujawnia spersonalizowany i stabilny mikrobiom funkcjonalny oraz ograniczone skutki interwencji probiotycznej u dorosłych. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Analizy asocjacyjne na dużą skalę identyfikują czynniki gospodarza wpływające na skład ludzkiego mikrobiomu jelitowego. Genetyka Natury, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, GT, DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C. i Chan, A. T. (2018). Stabilność ludzkiego mikrobiomu kałowego w kohorcie dorosłych mężczyzn. Mikrobiologia przyrodnicza, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A. i Kleiner, M. (2021). Ocena metod konserwacji i przechowywania próbek do analizy metaproteomicznej mikrobiomów jelitowych. Spektrum mikrobiologii, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nicea, EC (2022). Status proteomiki na początku lat 20. XX w.: w kierunku medycyny spersonalizowanej/precyzyjnej. Biochemia analityczna, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D. S. i Taslim, N. A. (2022). Działalność człowieka i zmiany w mikrobiomie jelitowym: perspektywa. Odżywianie człowieka i metabolizm, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, SA, Ning, Z., Starr, A.E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A. i Figeys, D. (2018). Metaproteomika ujawnia powiązania między mikrobiomem a białkami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jelit w dziecięcej chorobie zapalnej jelit. Komunikacja przyrodnicza, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4