探索商业阶段存储缓冲液的功效并评估个体之间的肠道宏蛋白质组变异性 (PROTEGI)

一、简介：

元蛋白质组学研究微生物群落的整个蛋白质补充，并提供对肠道微生物组等复杂生态系统的深入了解。 元蛋白质组学使研究人员能够深入研究肠道微生物组，深入了解这些微生物居民的丰度和功能活动。 这些知识有助于阐明各种疾病的机制，例如炎症性肠病（Zhang 等人，2018）和肥胖症（Biemann 等人，2021）。 研究人员可以通过识别关键的蛋白质特征，基于基础生物学（Nice，2022）制定个性化医疗和精准医疗的针对性策略。

在肠道微生物组研究中，标准化样本采集和保存对于保持微生物群落及其蛋白质组的完整性尤为重要。 事实上，为了获得可靠的结果，必须考虑对温度和氧气量等环境影响的敏感性。 对于肠道微生物组宏蛋白质组学研究，优选非侵入性或微创方法，以最大程度地减少破坏或污染，并保留天然微生物组成和蛋白质谱。 此外，样品处理和储存策略会影响蛋白质的降解和微生物种群的稳定性。 因此，通常建议立即冷冻或低温保存（例如 -80°C），以在分析之前保持样品完整性（Hickl 等人，2019）。 然而，使用冷链进行储存和运输与大规模和非本地研究所必需的现场采样策略不兼容。 此外，与潜在的室温选项相比，它不太理想，更昂贵，而且在后勤上也很繁琐。

此外，目前对粪便样本收集/保存方法的了解是基于在运送到实验室进行分析期间保存核酸或代谢物。 然而，蛋白质保存需要不同的策略，并且研究很少，并且依赖于采用核酸或代谢物分析中使用的设备或试剂（Mordant & Kleiner，2021）。 因此，定制和标准化的协议以及元数据收集对于确保宏蛋白质组研究的可重复性和可比性至关重要。

本研究旨在评估几种商业和无害缓冲液在一段时间内储存人类肠道粪便样本的适用性。 粪便样本将储存在五个不同的缓冲区中，并将与直接冷冻样本进行基准测试。 使用宏蛋白质组学，我们将比较蛋白质组学、分类学和功能鉴定，以了解这些缓冲液作为人类粪便的可靠存储解决方案的潜力。 这项研究是独一无二的，据我们所知，还没有类似的研究解决过这个棘手的问题。

人类的初步证据表明，宿主和微生物组的蛋白质组存在个体间和个体内的变异性（Mehta 等人，2018）。 特别是，随着时间的推移，肠道微生物组的个体内分类和功能变异似乎低于个体间变异。 然而，宏转录组学概况在受试者内部和受试者之间表现出相当的变异性。 因此，利用宏蛋白质组学，我们的目标是通过研究从参与者定期收集的粪便样本来评估蛋白质组水平上的个体间和个体内变异。

B. 学术和社会相关性：

该研究的第一部分旨在定义最有效的存储缓冲液，以在样品从采集地点到加工地点的运输过程中保持蛋白质完整性——这是宏蛋白质组学应用于健康和疾病的未来的关键因素。 尽管它很重要，但尚未对蛋白质组学应用进行类似的评估。 这些知识对于用于大规模人类粪便蛋白质组学研究的学术目的至关重要。 为了让人们通过宏蛋白质组学检查肠道健康并释放基于微生物群落的个性化医疗和治疗干预的潜力，需要一致的样本收集，而本研究将提供这一点。

该研究的第二部分旨在从蛋白质组学的角度了解肠道微生物组组成和功能中可以观察到的变异性。 肠道微生物组是动态的，并且已知会受到多种因素的改变，例如饮食（Kolmeder 等人，2016）、年龄（Ghosh 等人，2022）、遗传学（Kurilshikov 等人，2021）、环境（Nurkolis 等人）等，2022）等。 这些变异可大致分为个体间变异和个体内变异。 个体间变异是指群体或群体内个体之间观察到的差异，它们可以涵盖广泛的特征，包括基因构成、生理参数、生活方式因素和环境暴露。 了解来自同一“社区”的人的个体间差异对于个性化医疗等领域至关重要，在这些领域，量身定制的干预措施可以考虑个体差异，以优化治疗结果。 另一方面，个体内变异是指同一个体随时间或在不同条件下观察到的变化，可能由生物波动引起，例如昼夜节律、荷尔蒙波动或对刺激的生理反应。 识别和表征个体内变异性对于准确解释研究结果和评估生物测量的可靠性至关重要，特别是在纵向研究或临床监测场景中。 本研究旨在通过从参与者粪便样本中收集的蛋白质组学数据来了解这些变异性，并定义肠道微生物组中检测到的变量。

C. 目标：

1. 通过宏蛋白质组学图谱来确定用于储存和运输收集的人类粪便材料的五种不同缓冲液的效果。
2. 确定个体间和个体内水平上微生物群和宿主蛋白质组的变异性。

D. 研究设计：

在第一阶段，我们将部署以下现场粪便采样和运输保存方案： 将为参与者（在我们实验室/部门的成员中招募）提供 18 个试管（编号 1-18；15 ml 锥形离心机）试管；参考号 339650，Thermo Scientific 和 18 个易于使用的商业拭子（C1052-50，Zymo Research）或抹刀（DNAGenotek）。 18 管对应 6 种不同实验条件的 3 个储存时间点：空管（不含保存液）作为对照样品和 5 种不同的无害粪便保存液： (a) 带有 SDS 的内部缓冲液（称为 LB） (b) Zymo DNA/RNA Shield（R1100，Zymo Research），（c）Copan Amies 缓冲液（480CE，Copan Italia SpA），（d） OMNIgene·GUT（OM200，DNAGenotek），（e） OMNImet •GUT（ME200、DNAGenotek）。 简而言之，LB、Zymo Shield 和 OM200 已知含有有助于保存生物分子的去污剂，Copan Amies 缓冲液是一种无营养培养基，已知可保持细胞存活并被证明在培养组学中具有应用，而 ME200 是基于溶剂的有用培养基在代谢组学应用中。 此外，参与者还将收到一个展示在马桶上方的商用粪便收集器，以便于进行粪便采样（Servoprax Stuhlfaenger，参考号 H7 61000-50，来自 www.medundorg.de）和一个装有冰袋的小盒子，其中装有三个对照样品将被储存并运输到实验室。 这些冰存储的对照样本是评估不同存储缓冲区性能的关键。 参与者将在接下来的24小时内将样品带到我们的实验室。 实验室收到后，对照样品将储存在 -80°C 下，直到使用既定方案进行进一步生化处理（Gómez-Varela 等人，2023）。 其余样品将在轨道摇床培养箱内于 +20°C 下储存总共 2、5 和 10 天（模拟其中不同的储存/运输时间）。 在这些时间点结束时，样品将储存在 -80°C 下，直到使用既定方案进行进一步生化处理（Gómez-Varela 等人，2023）。 宏蛋白质组学概况（表明肠道微生物组和宿主生理学的分类学和功能变化；如戈麦斯-瓦雷拉，2023 年）这些样本将告诉我们最佳保存液体（定义为微生物组组成和功能更丰富的液体）如对照样品）。 该实验对于启动第二阶段的研究是必要的，并且在该领域是新颖的，因为目前还没有为宏蛋白质组学中最佳内部粪便采样实践制定指南。 将招募六名健康参与者（药物科学系药理学与毒理学处疼痛系统生物学实验室的成员）。 这是一项没有参与者分组的随机研究。 样品将被采集一次并分配到代表不同条件的18个试管中。 6名受试者的样本量足以找到最佳保存溶液，并且将在参与者正常排便的情况下进行一次采样。 此外，参与者还将填写一份调查问卷（附后），其中包括年龄、性别、体重指数、胃肠道症状评定量表（GSRS）、样本采集前最后30天内抗生素使用情况、布里斯托大便形式等信息规模 (BSFS)，以及在 18 个管中采集样品所需的大致时间（考虑到氧化过程的潜在影响）。

在第二阶段，参与者将需要在正常排便期间收集粪便样本 4 周（最多 10 次）。 他们将获得足够数量的 15ml 锥形离心管（339650，Thermo Scientific），其中含有性能最佳的保存缓冲液（如研究第一阶段中所定义，见上文），以及带有粪便收集器的商业收集装置。 在实验室收到样品后，样品将储存在 -80°C 下，直到使用既定方案进行进一步生化处理。 此外，参与者将填写一份调查问卷（见上文）。 参与者在收到参与本研究的所有风险和益处的解释后，并根据赫尔辛基宣言签署书面知情同意书（见附后的同意书）后，将自愿参加实验。 将指导参与者并为其提供必要的采样设备来收集粪便样本（见上文），并尽早将样本提交给药理学和毒理学系。 参与者需要完成自填问卷，其中包括上述信息。 对于第二阶段，考虑到可能的退出率为 20%，将从男女中招募 46 名健康参与者（我们实验室/部门的成员）（23 名男性和女性）。 这是一项没有参与者分组的随机研究。 样本量是根据 Kaczmarek 等人 2017 年报告的 Eggerthella 随时间估计的阈值计算的。 使用的统计程序是 F 检验 - 具有重复测量的双向方差分析，其值 Cohens'd = 0.75、1-β= 0.80 和 α= 0.05。 预计总共收集 400 - 460 个样本。

E、参考文献：

Biemann, R.、Buß, E.、Benndorf, D.、Lehmann, T.、Schallert, K.、Püttker, S.、Reichl, U.、Isermann, B.、Schneider, J. G.、Saake, G. 和海尔，R.（2021）。 粪便宏蛋白质组学揭示生活方式引起的体重减轻后肠道炎症减少并改变微生物代谢。 生物分子，11(5)，第 5 条。https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, T. S.、Shanahan, F. 和 O'Toole, P. W. (2022)。 肠道微生物组作为健康衰老的调节剂。 自然评论胃肠病学和肝病学，19（9），565-584。 https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D.、Xian, F.、Grundtner, S.、Sondermann, J. R. 和 Schmidt, M. (2023)。 通过 DIA-PASEF 宏蛋白质组学增强宿主-微生物组相互作用的分类学和功能表征。 微生物学前沿，14。https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L.、Musaad, S. M. 和 Holscher, H. D. (2017)。 一天中的时间和饮食行为与人类胃肠道微生物群的组成和功能有关。 美国临床营养学杂志，106(5), 1220-1231。 https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O.、Heintz-Buschart, A.、Trautwein-Schult, A.、Hercog, R.、Bork, P.、Wilmes, P. 和 Becher, D. (2019)。 样品保存和储存对人类肠道微生物组宏蛋白质组学研究的分类和功能特征产生重大影响。 微生物，7(9)，第 9 条。https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A.、Salojärvi, J.、Ritari, J.、de Been, M.、Raes, J.、Falony, G.、Vieira-Silva, S.、Kekkonen, R. A.、Corthals, G. L.、Palva, A.,萨洛宁，A. 和德沃斯，W.M. (2016)。 粪便宏蛋白质组学分析揭示了个性化且稳定的功能微生物组以及益生菌干预对成人的有限影响。 PloS One，11(4)，e0153294。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A.、Medina-Gomez, C.、Bacigalupe, R.、Radjabzadeh, D.、Wang, J.、Demirkan, A.、Le Roy, ​​C. I.、Raygoza Garay, J. A.、Finnicum, C. T.、Liu, X. , Zhernakova, D.V., Bonder, M.J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M.C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova ，A.（2021）。 大规模关联分析确定了影响人类肠道微生物组组成的宿主因素。 自然遗传学，53（2），156-165。 https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 梅塔，R.S.，阿布-阿里，G.S.，德鲁，D.A.，劳埃德-普莱斯，J.，萨勃拉曼尼亚，A.，洛赫黑德，P.，乔希，A.D.，艾维，K.L.，哈利利，H.，布朗，G.T.，杜隆， C.、Song, M.、Nguyen, L. H.、Mallick, H.、Rimm, E. B.、Izard, J.、Huttenhower, C. 和 Chan, A. T. (2018)。 一群成年男性中人类粪便微生物组的稳定性。 自然微生物学，3(3), 347-355。 https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 媒染剂，A.，＆克莱纳，M.（2021）。 肠道微生物组宏蛋白质组学分析的样品保存和储存方法的评估。 微生物学谱，9(3)，e0187721。 https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 尼斯，EC（2022）。 进入 2020 年代蛋白质组学的现状：迈向个性化/精准医学。 分析生物化学，644, 113840。 https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F.、Mayulu, N.、Yasmine, N.、Puspaningtyas, D. S. 和 Taslim, N. A. (2022)。 人类活动和肠道微生物组的变化：一个视角。 人类营养与新陈代谢，30，200165。 https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 张，X.，迪克，S.A.，宁，Z.，斯塔尔，A.E.，布彻，J.，李，J.，梅恩，J.，程，K.，廖，B.，李，L.，辛格尔顿， R.、Mack, D.、Stintzi, A. 和 Figeys, D. (2018)。 宏蛋白质组学揭示了儿科炎症性肠病中微生物组与肠道细胞外囊泡蛋白之间的关联。 自然通讯，9（1），2873。 https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4