Untersuchung der Wirksamkeit kommerzieller Speicherpuffer und Bewertung der Variabilität des Darmmetaproteoms zwischen Individuen (PROTEGI)

A. Einführung:

Die Metaproteomik untersucht das gesamte Proteinkomplement einer mikrobiellen Gemeinschaft und bietet Einblicke in komplexe Ökosysteme wie das Darmmikrobiom. Die Metaproteomik ermöglicht es Forschern, tief in die Darmmikrobiome einzutauchen und Einblicke in die Häufigkeit und funktionellen Aktivitäten dieser mikrobiellen Bewohner zu gewinnen. Dieses Wissen hat maßgeblich dazu beigetragen, die Mechanismen aufzuklären, die verschiedenen Krankheiten zugrunde liegen, beispielsweise entzündlichen Darmerkrankungen (Zhang et al., 2018) und Fettleibigkeit (Biemann et al., 2021). Forscher können gezielte Strategien für personalisierte Medizin und präzise Gesundheitsversorgung auf der Grundlage der zugrunde liegenden Biologie entwickeln (Nizza, 2022), indem sie wichtige Proteinsignaturen identifizieren.

Bei Darmmikrobiomstudien ist die standardisierte Probenentnahme und -konservierung besonders wichtig, um die Integrität der mikrobiellen Gemeinschaft und ihres Proteoms zu bewahren. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, muss die Anfälligkeit gegenüber Umwelteinflüssen wie Temperatur und Sauerstoffgehalt berücksichtigt werden. Für metaproteomische Untersuchungen des Darmmikrobioms werden nicht-invasive oder minimal-invasive Methoden bevorzugt, um Störungen oder Kontaminationen zu minimieren und die native mikrobielle Zusammensetzung und die Proteinprofile zu bewahren. Außerdem wirken sich die Probenhandhabungs- und Lagerungsstrategien auf den Abbau von Proteinen und die Stabilität der Mikrobenpopulation aus. Aus diesem Grund wird häufig ein sofortiges Einfrieren oder eine Aufbewahrung bei niedrigen Temperaturen (z. B. -80 °C) empfohlen, um die Probenintegrität bis zur Analyse aufrechtzuerhalten (Hickl et al., 2019). Die Verwendung einer Kühlkette für Lagerung und Transport ist jedoch nicht mit einer Vor-Ort-Probenahmestrategie vereinbar, die für groß angelegte und dezentrale Studien erforderlich ist. Darüber hinaus ist es weniger ideal, teurer und logistisch aufwändiger als mögliche Raumtemperaturoptionen.

Darüber hinaus basiert das derzeitige Wissen über Methoden zur Sammlung/Konservierung von Stuhlproben auf der Konservierung von Nukleinsäuren oder Metaboliten während des Transports zum Labor zur Analyse. Allerdings erfordert die Proteinkonservierung unterschiedliche Strategien und Studien sind rar und beruhen auf der Übernahme der Geräte oder Reagenzien, die bei der Analyse von Nukleinsäuren oder Metaboliten verwendet werden (Mordant & Kleiner, 2021). Daher sind maßgeschneiderte und standardisierte Protokolle zusammen mit der Metadatenerfassung unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit zwischen metaproteomischen Studien sicherzustellen.

Die vorliegende Studie zielt darauf ab, die Eignung mehrerer kommerzieller und ungefährlicher Puffer für die Lagerung menschlicher Darmfäkalienproben im Laufe der Zeit zu bewerten. Stuhlproben werden in fünf verschiedenen Puffern gelagert und mit direkt gefrorenen Proben verglichen. Mithilfe der Metaproteomik werden wir die proteomischen, taxonomischen und funktionellen Identifizierungen vergleichen, um das Potenzial dieser Puffer als zuverlässige Speicherlösung für menschlichen Kot zu verstehen. Diese Forschung ist einzigartig und nach unserem besten Wissen hat sich keine vergleichbare Studie mit dieser anspruchsvollen Frage befasst.

Vorläufige Erkenntnisse beim Menschen haben eine inter- und intraindividuelle Variabilität der Proteome des Wirts und der Mikrobiome gezeigt (Mehta et al., 2018). Insbesondere scheint die intraindividuelle taxonomische und funktionelle Variation im Darmmikrobiom im Laufe der Zeit geringer zu sein als die interindividuelle Variation. Metatranskriptomics-Profile zeigten jedoch eine vergleichbare Variabilität innerhalb und zwischen Probanden. Daher wollen wir mithilfe der Metaproteomik die inter- und intraindividuellen Variabilitäten auf Proteomebene bewerten, indem wir regelmäßig Stuhlproben von Teilnehmern untersuchen.

B. Die akademische und gesellschaftliche Relevanz:

Der erste Teil der Studie zielt darauf ab, den effektivsten Speicherpuffer zur Wahrung der Proteinintegrität während des Probentransports vom Ort der Sammlung zum Ort der Verarbeitung zu definieren – ein Schlüsselfaktor für die Zukunft der Metaproteomik bei der Anwendung auf Gesundheit und Krankheit. Trotz seiner Bedeutung wurde eine ähnliche Bewertung für proteomische Anwendungen nicht durchgeführt. Dieses Wissen wird für akademische Zwecke von entscheidender Bedeutung sein und für groß angelegte proteomische Studien im menschlichen Stuhl genutzt werden. Damit Menschen ihre Darmgesundheit durch Metaproteomik untersuchen lassen und das Potenzial mikrobieller Gemeinschaften basierender personalisierter Medizin und therapeutischer Interventionen erschließen können, ist eine konsistente Probenentnahme erforderlich, und diese Studie wird sie liefern.

Der zweite Teil der Studie soll die Variabilität verstehen, die in der Zusammensetzung und den Funktionen des Darmmikrobioms aus proteomischer Sicht beobachtet werden kann. Das Darmmikrobiom ist dynamisch und wird bekanntermaßen durch mehrere Faktoren wie Ernährung (Kolmeder et al., 2016), Alter (Ghosh et al., 2022), Genetik (Kurilshikov et al., 2021) und Umwelt (Nurkolis et al.) verändert al., 2022) usw. Diese Variationen können grob in inter- und intraindividuelle Unterschiede eingeteilt werden. Unter interindividueller Variabilität versteht man die beobachteten Unterschiede zwischen Individuen innerhalb einer Population oder Gruppe. Sie kann ein breites Spektrum an Merkmalen umfassen, darunter genetische Ausstattung, physiologische Parameter, Lebensstilfaktoren und Umwelteinflüsse. Das Verständnis der interindividuellen Variabilität von Menschen derselben „Gemeinschaft“ ist in Bereichen wie der personalisierten Medizin von entscheidender Bedeutung, wo maßgeschneiderte Interventionen individuelle Unterschiede berücksichtigen, um Behandlungsergebnisse zu optimieren. Unter intraindividueller Variabilität versteht man hingegen Schwankungen, die innerhalb desselben Individuums im Laufe der Zeit oder unter unterschiedlichen Bedingungen beobachtet werden und aus biologischen Schwankungen wie zirkadianen Rhythmen, hormonellen Schwankungen oder physiologischen Reaktionen auf Reize resultieren können. Das Erkennen und Charakterisieren der intraindividuellen Variabilität ist entscheidend für die genaue Interpretation von Forschungsergebnissen und die Beurteilung der Zuverlässigkeit biologischer Messungen, insbesondere in Längsschnittstudien oder klinischen Überwachungsszenarien. Diese Studie zielt darauf ab, diese Variabilitäten anhand der aus den Stuhlproben der Teilnehmer gesammelten Proteomikdaten zu verstehen und die im Darmmikrobiom erkannten Variablen zu definieren.

C. Ziele:

1. Ermittlung der Wirkung von fünf verschiedenen Puffern, die für die Lagerung und den Transport von gesammeltem menschlichem Fäkalienmaterial verwendet werden, anhand metaproteomischer Profile.
2. Bestimmung der Variabilität von Mikrobiota und Wirtsproteomen auf inter- und intraindividueller Ebene.

D. Studiendesign:

In der ersten Phase werden wir das folgende Protokoll für die Stuhlprobenahme vor Ort und die Transportkonservierung anwenden: Den Teilnehmern (rekrutiert unter den Mitgliedern unseres Labors/ unserer Abteilung) werden 18 Röhrchen (nummeriert von 1-18; konische 15-ml-Zentrifuge) zur Verfügung gestellt Röhrchen; Ref.-Nr. 339650, Thermo Scientific und 18 einfach zu verwendende kommerzielle Tupfer (C1052-50, Zymo Research) oder Spatel (DNAGenotek). Die 18 Röhrchen entsprechen drei Lagerungszeitpunkten von 6 verschiedenen Versuchsbedingungen: einem leeren Röhrchen (ohne Konservierungsflüssigkeit) als Kontrollprobe und 5 verschiedenen ungefährlichen Fäkalienkonservierungsflüssigkeiten: (a) Interner Puffer (LB genannt) mit SDS und Harnstoff, kommerziell erhältlich (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) Copan Amies-Puffer (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •Darm (ME200, DNAGenotek). Kurz gesagt, LB, Zymo Shield und OM200 enthalten bekanntermaßen Detergenzien, die zur Konservierung der Biomoleküle beitragen, Copan Amies-Puffer ist ein nährstofffreies Medium, das die Zellen bekanntermaßen lebensfähig hält und nachweislich in der Kulturwissenschaft Anwendung findet, und ME200 ist nützlich auf Lösungsmittelbasis in metabolomischen Anwendungen. Darüber hinaus erhalten die Teilnehmer einen handelsüblichen Stuhlfänger, der zur Erleichterung der Stuhlentnahme über der Toilette angebracht wird (Servoprax Stuhlfaenger, Referenznummer H7 61000-50 von www.medundorg.de) und eine kleine Box mit Eisbeuteln, in denen die drei Kontrollen stattfinden Die Proben werden gelagert und zum Labor transportiert. Diese im Eis gelagerten Kontrollproben sind der Schlüssel zur Bewertung der Leistung der verschiedenen Speicherpuffer. Die Teilnehmer bringen die Proben innerhalb der folgenden 24 Stunden in unser Labor. Nach Eingang im Labor werden die Kontrollproben bis zur weiteren biochemischen Verarbeitung unter Verwendung etablierter Protokolle bei -80 °C gelagert (Gómez-Varela et al., 2023). Der Rest der Proben wird bei +20 °C in einem Orbitalschüttler-Inkubator für insgesamt 2, 5 und 10 Tage gelagert (wodurch unterschiedliche Lager-/Transportzeiten simuliert werden). Am Ende dieser Zeitpunkte werden die Proben bis zur weiteren biochemischen Verarbeitung unter Verwendung etablierter Protokolle bei -80 °C gelagert (Gómez-Varela et al., 2023). Die metaproteomischen Profile (die auf die taxonomischen und funktionellen Veränderungen im Darmmikrobiom und der Wirtsphysiologie hinweisen; wie in Gomez-Varela, 2023) aus diesen Proben werden uns über die beste Konservierungsflüssigkeit informieren (definiert als diejenige, bei der die Zusammensetzung und Funktion des Mikrobioms besser ist). wie die Kontrollprobe). Dieses Experiment ist für den Beginn der Phase II der Studie erforderlich und auf diesem Gebiet neu, da keine Richtlinien für die besten internen Verfahren zur Stuhlentnahme in der Metaproteomik festgelegt wurden. Sechs gesunde Teilnehmer (unter den Mitgliedern des Labors für Systembiologie des Schmerzes, Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie, Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften) werden rekrutiert. Es handelt sich um eine randomisierte Studie ohne Teilnehmergruppen. Die Proben werden einmal gesammelt und auf 18 Röhrchen verteilt, die unterschiedliche Bedingungen darstellen. Eine Stichprobengröße von 6 Probanden reicht aus, um die beste Konservierungslösung zu finden, und die Probenahme wird von den Teilnehmern einmalig bei normalem Stuhlgang durchgeführt. Darüber hinaus füllen die Teilnehmer einen Fragebogen (im Anhang) aus, der Informationen wie Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, die Bewertungsskala für gastrointestinale Symptome (GSRS), die Verabreichung von Antibiotika in den letzten 30 Tagen vor der Probenentnahme und die Bristol-Stuhlform enthält Skala (BSFS) und die ungefähre Zeit, die für die Probenentnahme in den 18 Röhrchen benötigt wird (um mögliche Auswirkungen aufgrund von Oxidationsprozessen zu berücksichtigen).

In der zweiten Phase wird von den Teilnehmern erwartet, dass sie während ihres regulären Stuhlgangs vier Wochen lang Stuhlproben sammeln (maximal zehn verschiedene Zeiten). Sie erhalten eine ausreichende Anzahl konischer 15-ml-Zentrifugenröhrchen (339650, Thermo Scientific), die den leistungsstärksten Konservierungspuffer (wie in der ersten Phase der Studie definiert, siehe oben) enthalten, sowie ein handelsübliches Sammelgerät mit Stuhlfänger . Nach Eingang im Labor werden die Proben bis zur weiteren biochemischen Verarbeitung nach festgelegten Protokollen bei -80 °C gelagert. Darüber hinaus füllen die Teilnehmer einen Fragebogen aus (siehe oben). Die Teilnehmer nehmen freiwillig an dem Experiment teil, nachdem sie eine Erläuterung aller Risiken und Vorteile einer Teilnahme an der vorliegenden Studie erhalten und die schriftliche Einverständniserklärung gemäß der Deklaration von Helsinki unterzeichnet haben (siehe die beigefügte Einverständniserklärung). Die Teilnehmer werden eingewiesen und mit den notwendigen Probenahmegeräten ausgestattet, um Stuhlproben zu sammeln (siehe oben) und die Proben zum frühestmöglichen Zeitpunkt an die Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie einzureichen. Von den Teilnehmern wird erwartet, dass sie selbst ausgefüllte Fragebögen ausfüllen, die Informationen wie die oben beschriebenen enthalten. Für die zweite Phase werden 46 gesunde Teilnehmer (unter den Mitgliedern unseres Labors/ unserer Abteilung) beiderlei Geschlechts (23 Männer und Frauen) rekrutiert, wobei eine mögliche Abbrecherquote von 20 % berücksichtigt wird. Es handelt sich um eine randomisierte Studie ohne Teilnehmergruppen. Die Stichprobengröße wurde auf der Grundlage des von Kaczmarek et al., 2017, berichteten Schwellenwerts der Eggerthella-Schätzungen mit der Zeit berechnet. Das verwendete Statistikverfahren ist F-Tests – zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen mit den folgenden Werten: Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 und α= 0,05. Es wird erwartet, dass insgesamt 400 bis 460 Proben gesammelt werden.

E. Referenzen:

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