PRObar la eficacia de los tampones de almacenamiento en etapa comerciales y evaluar la variabilidad del metaproteoma intestinal entre individuos (PROTEGI)

A. Introducción:

La metaproteómica estudia todo el complemento proteico de una comunidad microbiana y ofrece información sobre ecosistemas complejos como el microbioma intestinal. La metaproteómica permite a los investigadores profundizar en los microbiomas intestinales, proporcionando información sobre la abundancia y las actividades funcionales de estos habitantes microbianos. Este conocimiento ha sido fundamental para dilucidar los mecanismos subyacentes a diversas enfermedades, como la enfermedad inflamatoria intestinal (Zhang et al., 2018) y la obesidad (Biemann et al., 2021). Los investigadores pueden desarrollar estrategias específicas para la medicina personalizada y la atención sanitaria de precisión basadas en la biología subyacente (Nice, 2022) mediante la identificación de firmas de proteínas clave.

En los estudios del microbioma intestinal, la recolección y preservación de muestras estandarizadas son particularmente cruciales para preservar la integridad de la comunidad microbiana y su proteoma. De hecho, para obtener resultados fiables se debe considerar la susceptibilidad a influencias ambientales como la temperatura y la cantidad de oxígeno. Para los estudios metaproteómicos del microbioma intestinal, se prefieren métodos no invasivos o mínimamente invasivos para minimizar la alteración o contaminación y preservar la composición microbiana nativa y los perfiles de proteínas. Además, las estrategias de manejo y almacenamiento de muestras afectan la degradación de proteínas y la estabilidad de la población microbiana. Por este motivo, a menudo se recomienda la congelación inmediata o la conservación a bajas temperaturas (p. ej., -80 °C) para mantener la integridad de la muestra hasta el análisis (Hickl et al., 2019). Sin embargo, utilizar una cadena de frío para el almacenamiento y el transporte no es compatible con una estrategia de muestreo in situ, necesaria para estudios deslocalizados y a gran escala. Además, es menos ideal, más caro y logísticamente tedioso que las posibles opciones a temperatura ambiente.

Además, el conocimiento actual de los métodos de recolección/conservación de muestras fecales se basa en la conservación de ácidos nucleicos o metabolitos durante el transporte al laboratorio para su análisis. Sin embargo, la preservación de proteínas requiere estrategias diferentes y los estudios son escasos y dependen de la adopción de los dispositivos o reactivos utilizados en el caso del análisis de ácidos nucleicos o metabolitos (Mordant & Kleiner, 2021). Por lo tanto, los protocolos personalizados y estandarizados junto con la recopilación de metadatos son esenciales para garantizar la reproducibilidad y comparabilidad entre los estudios metaproteómicos.

El presente estudio tiene como objetivo evaluar la idoneidad de varios tampones comerciales y no peligrosos para el almacenamiento de muestras fecales del intestino humano a lo largo del tiempo. Las muestras fecales se almacenarán en cinco tampones diferentes y se compararán con muestras directamente congeladas. Utilizando la metaproteómica compararemos las identificaciones proteómicas, taxonómicas y funcionales para comprender el potencial de estos tampones como una solución de almacenamiento confiable para las heces humanas. Esta investigación es única y, hasta donde sabemos, ningún estudio similar ha abordado esta exigente cuestión.

La evidencia preliminar en humanos ha demostrado variabilidad inter e intraindividual de los proteomas del huésped y los microbiomas (Mehta et al., 2018). En particular, la variación taxonómica y funcional intraindividual en el microbioma intestinal parece ser menor que la variación interindividual a lo largo del tiempo. Sin embargo, los perfiles metatranscriptómicos mostraron una variabilidad comparable dentro y entre los sujetos. Por lo tanto, utilizando la metaproteómica, nuestro objetivo es evaluar las variabilidades inter e intraindividuales a nivel de proteoma mediante el estudio de muestras fecales recolectadas periódicamente de los participantes.

B. La relevancia académica y social:

La primera parte del estudio tiene como objetivo definir el tampón de almacenamiento más eficaz para preservar la integridad de las proteínas durante el transporte de la muestra desde el sitio de recolección hasta el sitio de procesamiento, un factor clave en el futuro de la metaproteómica aplicada a la salud y la enfermedad. A pesar de su importancia, no se ha realizado una evaluación similar para aplicaciones proteómicas. Este conocimiento será fundamental para fines académicos que se utilizarán en estudios proteómicos fecales humanos a gran escala. Para que las personas puedan examinar su salud intestinal a través de la metaproteómica y desbloquear el potencial de la medicina personalizada y las intervenciones terapéuticas basadas en comunidades microbianas, será necesaria una recolección de muestras consistente y este estudio lo proporcionará.

La segunda parte del estudio está diseñada para comprender la variabilidad que se puede observar en la composición y funciones del microbioma intestinal desde la perspectiva proteómica. El microbioma intestinal es dinámico y se sabe que está alterado por múltiples factores, como la dieta (Kolmeder et al., 2016), la edad (Ghosh et al., 2022), la genética (Kurilshikov et al., 2021), el medio ambiente (Nurkolis et al., 2022), etc. Estas variaciones pueden clasificarse en términos generales en inter e intraindividuales. La variabilidad interindividual se refiere a las diferencias observadas entre individuos dentro de una población o grupo, y pueden abarcar una amplia gama de características, incluida la composición genética, parámetros fisiológicos, factores de estilo de vida y exposiciones ambientales. Comprender la variabilidad interindividual de personas de la misma "comunidad" es esencial en campos como la medicina personalizada, donde las intervenciones adaptadas tienen en cuenta las diferencias individuales para optimizar los resultados del tratamiento. La variabilidad intraindividual, por otro lado, se refiere a las variaciones observadas dentro del mismo individuo a lo largo del tiempo o en diferentes condiciones y puede surgir de fluctuaciones biológicas, como los ritmos circadianos, las fluctuaciones hormonales o las respuestas fisiológicas a los estímulos. Reconocer y caracterizar la variabilidad intraindividual es crucial para interpretar con precisión los resultados de la investigación y evaluar la confiabilidad de las mediciones biológicas, particularmente en estudios longitudinales o escenarios de seguimiento clínico. Este estudio tiene como objetivo comprender estas variabilidades a través de los datos proteómicos recopilados de las muestras fecales de los participantes y definir las variables detectadas en el microbioma intestinal.

C. Objetivos:

1. Identificar el efecto de cinco tampones diferentes utilizados para el almacenamiento y transporte de materia fecal humana recolectada, mediante perfiles metaproteómicos.
2. Determinar la variabilidad de la microbiota y los proteomas del huésped a nivel inter e intraindividual.

D. Diseño del estudio:

Para la primera fase, implementaremos el siguiente protocolo para el muestreo de heces in situ y la preservación del transporte: Los participantes (reclutados entre los miembros de nuestro laboratorio/División) recibirán 18 tubos (numerados del 1 al 18; centrífuga cónica de 15 ml). tubos Ref# 339650, Thermo Scientific y 18 hisopos comerciales fáciles de usar (C1052-50, Zymo Research) o espátulas (DNAGenotek). Los 18 tubos corresponden a tres momentos de almacenamiento de 6 condiciones experimentales diferentes: un tubo vacío (sin líquido de conservación) como muestra de control y 5 líquidos de conservación fecal diferentes no peligrosos: (a) Tampón interno (llamado LB) con SDS y urea, obtenida comercialmente (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) tampón Copan Amies (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •INTEO (ME200, DNAGenotek). Brevemente, se sabe que LB, Zymo Shield y OM200 contienen detergentes que ayudan a preservar las biomoléculas, el tampón Copan Amies es un medio libre de nutrientes conocido por mantener las células viables y ha demostrado tener aplicaciones en culturómica, y ME200 es útil a base de solventes. en aplicaciones metabolómicas. Además, los participantes recibirán un recogedor de heces comercial que se coloca encima del inodoro para facilitar la toma de muestras de heces (Servoprax Stuhlfaenger, número de referencia H7 61000-50 de www.medundorg.de) y una cajita con bolsas de hielo en las que se encuentran los tres controles. Las muestras se almacenarán y transportarán al laboratorio. Estas muestras de control almacenadas en hielo son clave para evaluar el rendimiento de los diferentes buffers de almacenamiento. Los participantes traerán las muestras a nuestro laboratorio en las siguientes 24 horas. Al recibirlas en el laboratorio, las muestras de Control se almacenarán a -80°C hasta su posterior procesamiento bioquímico utilizando los protocolos establecidos (Gómez-Varela et al., 2023). El resto de las muestras se almacenarán a +20°C dentro de una incubadora con agitador orbital durante un total de 2, 5 y 10 días (simulando diferentes tiempos de almacenamiento/transporte de los mismos). Al final de estos tiempos, las muestras se almacenarán a -80 °C hasta su posterior procesamiento bioquímico utilizando protocolos establecidos (Gómez-Varela et al., 2023). Los perfiles metaproteómicos (que indican los cambios taxonómicos y funcionales en el microbioma intestinal y la fisiología del huésped; como en Gómez-Varela, 2023 a partir de estas muestras nos informarán sobre el mejor líquido de conservación (definido como aquel donde la composición y función del microbioma son más como la muestra de control). Este experimento es necesario para iniciar la Fase II del estudio y es novedoso en el campo ya que no se establecen pautas para las mejores prácticas internas de muestreo fecal en metaproteómica. Se reclutarán seis participantes sanos (entre los miembros del laboratorio de Biología de Sistemas del Dolor, División de Farmacología y Toxicología, Departamento de Ciencias Farmacéuticas). Este es un estudio aleatorizado sin grupos de participantes. Las muestras se recolectarán una vez y se distribuirán en 18 tubos que representan diferentes condiciones. Un tamaño de muestra de 6 sujetos será suficiente para encontrar la mejor solución de conservación y los participantes realizarán el muestreo una vez bajo evacuación intestinal normal. Además, los participantes completarán un cuestionario (adjunto) que incluye información como edad, sexo, índice de masa corporal, escala de calificación de síntomas gastrointestinales (GSRS), administración de antibióticos en los últimos 30 días antes de la recolección de la muestra, formulario de heces de Bristol. escala (BSFS) y el tiempo aproximado necesario para la recolección de muestras en los 18 tubos (para tener en cuenta los posibles efectos debidos a los procesos de oxidación).

Para la segunda fase, se espera que los participantes recolecten muestras fecales durante 4 semanas durante su defecación habitual (diez momentos diferentes como máximo). Se les proporcionará una cantidad adecuada de tubos de centrífuga cónicos de 15 ml (339650, Thermo Scientific) que contienen el tampón de conservación de mejor rendimiento (como se definió en la primera fase del estudio, ver arriba) y un dispositivo de recolección comercial con un recogedor de heces. . Una vez recibidas en el laboratorio, las muestras se almacenarán a -80 ° C hasta su posterior procesamiento bioquímico utilizando protocolos establecidos. Además, los participantes completarán un cuestionario (ver arriba). Los participantes participarán voluntariamente en el experimento después de recibir una explicación de todos los riesgos y beneficios de participar en el presente estudio y después de firmar el formulario de consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Helsinki (ver el formulario de consentimiento adjunto). Los participantes recibirán instrucciones y se les proporcionarán los dispositivos de muestreo necesarios para recolectar muestras de heces (ver arriba) y enviar las muestras al Departamento de Farmacología y Toxicología lo antes posible. Se espera que los participantes completen cuestionarios autoadministrados que incluyan información como la descrita anteriormente. Para la segunda fase, se reclutarán 46 participantes sanos (entre los miembros de nuestro laboratorio/División) de ambos sexos (23 hombres y mujeres) considerando una posible tasa de abandono del 20%. Este es un estudio aleatorizado sin grupos de participantes. El tamaño de la muestra se calculó con base en el umbral de estimaciones de Eggerthella con el tiempo informado por Kaczmarek et al., 2017. El procedimiento estadístico utilizado son las pruebas F - ANOVA de dos vías con medidas repetidas con los siguientes valores Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 y α= 0,05. Se espera recolectar entre 400 y 460 muestras.

E. Referencias:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & Heyer, R. (2021). La metaproteómica fecal revela una reducción de la inflamación intestinal y cambios en el metabolismo microbiano después de la pérdida de peso inducida por el estilo de vida. Biomoléculas, 11(5), artículo 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, TS, Shanahan, F. y O'Toole, PW (2022). El microbioma intestinal como modulador del envejecimiento saludable. Nature Reviews Gastroenterología y hepatología, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R. y Schmidt, M. (2023). Aumento de la caracterización taxonómica y funcional de las interacciones huésped-microbioma mediante la metaproteómica DIA-PASEF. Fronteras en Microbiología, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, JL, Musaad, SM y Holscher, HD (2017). La hora del día y las conductas alimentarias están asociadas con la composición y función de la microbiota gastrointestinal humana. Revista estadounidense de nutrición clínica, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P. y Becher, D. (2019). La preservación y el almacenamiento de muestras tienen un impacto significativo en los perfiles taxonómicos y funcionales en los estudios metaproteómicos del microbioma intestinal humano. Microorganismos, 7(9), artículo 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A. y de Vos, WM (2016). El análisis metaproteómico fecal revela un microbioma funcional personalizado y estable y efectos limitados de una intervención probiótica en adultos. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Los análisis de asociación a gran escala identifican factores del huésped que influyen en la composición del microbioma intestinal humano. Genética de la naturaleza, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, G. T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C. y Chan, A. T. (2018). Estabilidad del microbioma fecal humano en una cohorte de hombres adultos. Microbiología de la naturaleza, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A. y Kleiner, M. (2021). Evaluación de métodos de conservación y almacenamiento de muestras para análisis metaproteómicos de microbiomas intestinales. Espectro de microbiología, 9 (3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Niza, E. C. (2022). El estado de la proteómica al entrar en la década de 2020: hacia una medicina personalizada/de precisión. Bioquímica analítica, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D. S. y Taslim, N. A. (2022). Actividades humanas y cambios en el microbioma intestinal: una perspectiva. Nutrición humana y metabolismo, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, S. A., Ning, Z., Starr, A. E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A. y Figeys, D. (2018). La metaproteómica revela asociaciones entre el microbioma y las proteínas de las vesículas extracelulares intestinales en la enfermedad inflamatoria intestinal pediátrica. Comunicaciones de la naturaleza, 9 (1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4